Pull to refresh
0
«Атлас»
Флагман персонализированной медицины в России

Микробиота. История изучения и методы исследования

Reading time 7 min
Views 9.1K
Мы получили много комментариев к последней статье и решили с Атласом дополнить серию материалом о том, какие еще есть методы изучения микробиоты. В конце статьи добавили, что нужно помнить об исследованиях бактерий кишечника на сегодняшний день, чтобы они не навредили вашему здоровью.


Автор иллюстраций Rentonorama

С чего началось изучение микробиоты


Микробиоту кишечника называют новым органом в теле человека. О других органах мы более или менее знали давно, но о том, что бактерии выполняют важные для человека функции, стало известно только в конце XX века. Началось изучение микробиоты еще в XVII веке. Создатель микроскопа и «отец микробиологии» Антони Ван Левенгук впервые рассмотрел и описал бактерии полости рта и фекалий.

В 1828 году Кристиан Эренберг вводит новый термин Bacterium. В тот момент он изучал кишечную палочку (Escherichia coli) — вид бактерий без спор. Для спорообразующих бактерий Кристиан придумал термин Bacillus. Этот вид бактерий активно изучал Роберт Кох. Он же выявил взаимосвязь между патогенными представителями этого рода и заболеваниями, такими как сибирская язва и туберкулез.

Уже в XIX веке исследователям было понятно, что здоровье человека тесно связано с бактериями. Однако полноценно изучать микробиоту стало возможно после открытия технологии секвенирования генов Фредериком Сенгером. В чашках Петри способны жить и расти далеко не все виды, поэтому подробно классифицировать и определить функции бактерий было сложно.

Одновременно с развитием технологий в 70-х годах микробиолог Карл Вёзе предложил классифицировать микроорганизмы на основе секвенирования молекулы 16s рРНК, по которой удобно сверять нуклеотидные последовательности и определять степень родства. По данным анализа Карл разделил все микроорганизмы на археи, бактерии и эукариоты. Эта классификация используется и сейчас.



Эукариоты отличаются наличием ядра, а у бактерий и архей его нет. Археи — это простые одноклеточные микроорганизмы, которые живут в экстремальных условиях (в гейзерах, на дне морей и океанов). А еще они самые древние: археи существуют на Земле примерно 4 миллиарда лет. Также среди них нет паразитарных и патогенных микроорганизмов, а среди бактерий есть, хотя не так много как нам кажется — около 1%.

В кишечнике человека археи производят метан. Также чем их больше, тем ниже риск ожирения, но причинно-следственная связь остается неясной. Археи есть далеко не у всех и редко выходят за пределы 1–2%.

Бактерии живут в самых разных средах и мы контактируем с ними намного больше, чем с археями. Они отличаются рядом функций. Например, бактерии могут разрывать молекулы углеводов и производить жирные кислоты, а археи — нет.

Как изучают микробиоту


Перед тем как погружаться в исследования, давайте сначала освежим знания о работе ДНК, РНК и синтезе белка.

Для правильной работы организму нужны белки. Тканям кожи, чтобы поддерживать защитную функцию, — требуются одни; клеткам глаз, чтобы орган работал правильно, — другие. Иногда разным клеткам и тканям требуется один и тот же белок. Чтобы создавать белки, клетки используют ДНК как инструкцию.

Сначала определяется участок, в котором содержится нужная информация. Двуспиральная ДНК разматывается и копируется только одна ее сторона. Затем ДНК сматывается обратно, а копию ее одной стороны (РНК) подхватывает рибосома. Она считывает последовательность и строит по ней цепочку аминокислот, которая потом приобретает форму и становится белком.

Это можно сравнить с готовкой по старинной книге рецептов. Сначала мы выписываем рецепт, чтобы не использовать лишний раз хрупкую, но ценную книгу. Далее по рецепту мы соединяем разные продукты, как рибосома аминокислоты, чтобы получить готовое блюдо. Для клетки блюдо — белок, который она использует дальше для своих нужд. Кроме белка микроорганизмы производят другие соединения, например жирные кислоты, которые считаются метаболитами.

Для изучения микроорганизмов в основном используют четыре подхода: метагеномное — исследование ДНК, метатранскриптомное — изучение РНК, метапротеомика — изучение белков, метаболомика — изучение метаболитов.

Метагеномное секвенирование


Метагеном — набор генов всех организмов в изучаемой среде. Суть такого анализа в секвенировании гена 16s рРНК, который отвечает за работу рибосомальной РНК, или в секвенировании всей ДНК. Такое исследование отвечает на вопросы «какие организмы находятся в образце и какие функции они потенциально выполняют?» Подробно об этой технологии мы рассказывали в предыдущей статье, так как на ней строится тест «Генетика микробиоты».

Обычно под исследованием микробиоты имеют в виду именно этот тип анализа, потому что его первым стали масштабно использовать для изучения бактерий. После появления технологии секвенирования ДНК ученые запустили глобальный проект по изучению почв, морей, горячих источников. Благодаря метагеномному анализу, база данных микроорганизмов росла в геометрической прогрессии. Секвенирование позволяет изучать бактерии в естественной среде, тогда как в лабораторных условиях многие из них погибают.



В 2007 году исследователи США начали проект по изучению микробиома тела человека Human Microbiome Project. Он стал толчком к масштабному изучению состава бактерий кишечника на основе метагеномных данных. Вслед за HMP в Европе в 2008 году запустили похожий проект по изучению микробиоты человека — MetaHit.

Суть метагеномных исследований в том, чтобы понять, какие микроорганизмы живут в образце, сколько их там и какие функции они выполняют. Анализ не позволяет напрямую оценить, какие соединения производит сообщество бактерий. Однако, благодаря множеству метагеномных исследований, мы можем прогнозировать это опосредованно. Например, если у человека больше бактерий-производителей масляной кислоты — его микробиота, вероятно, хорошо ее вырабатывает.

Метагеномные исследования получили широкое распространение потому, что их проще провести в сравнении с другими методами. Для изучения РНК, белков и метаболитов требуется сложная очистка образцов и более трудоемкие анализы.

По метагеномным данным мы имеем больше всего результатов. Это наглядно видно по базе всех научных статей и клинических исследований PubMed. Поиск по запросу metagenomic microbiome выдает около 4500 различных статей, запрос metatranscriptomic microbiome — всего 225, metaproteomic microbiome — 100, metabolomic microbiome — 1600.

Метатранскриптомное секвенирование


Транскриптом — совокупность всех молекул матричной РНК (мРНК), которые синтезирует одна клетка или группа микроорганизмов. При метатранскриптомном анализе изучают непосредственно РНК, а не ген, который ее кодирует.

Бывает так, что бактерия есть, но она никак не участвует в жизни микробного сообщества: у нее есть неактивные гены, которые не копируются молекулой РНК. Метатранскриптомные исследования позволяют оценить именно активную часть микробиоты. Однако молекула РНК не так стабильна, как ДНК, и быстро распадается. Поэтому выделить и сохранить ее для анализов сложнее и дороже.



Часто транскриптомные исследования используют для изучения определенных функций генов. В таком случае результаты исследования РНК сверяют с метагеномными данными. Так ученые получают более полную информацию о работе микроорганизмов. Метатранскриптомные исследования микробиома могут быть полезны, чтобы более точно определить потенциал к синтезу различных метаболитов.

Метапротеомика


При таком подходе изучаются все белки, которые находятся в образце. Метапротеомика дает информацию о структуре, функциях и динамике микробного сообщества. Ученые узнают больше о том, как организмы взаимодействуют друг с другом, соревнуются за питание, производят метаболиты.

Сначала из образца выделяют белки. Часто для этого используют жидкостную хроматографию. Затем проводят дополнительный анализ для определения молекулярной массы — масс-спектрометрию. Так мы получаем информацию о фрагментах белка (пептидах), но не о белке целиком. Чтобы собрать осколки в единое целое, используется специальные программы, и ученые получают готовые данные.



Метопротеомика в настоящий момент менее популярна, чем исследование ДНК и РНК. Это связано со сложностью проведения исследований и высокой вероятностью ошибки. В образце может быть много белков человека или еды. Однако метапротеомика может помочь ученым пролить свет на взаимодействия между бактериями и нарушения работы микробиоты у людей с заболеваниями.

Метаболомика


При таком типе анализа исследуются метаболиты — вещества, которые бактерии производят. Это могут быть аминокислоты, липиды, сахара, жирные кислоты (в том числе масляная) и другие соединения. Сейчас описано около 40 000 метаболитов тела человека, и все они зафиксированы в большой базе данных.



В качестве образца для исследования метаболитов можно использовать любую жидкость из тела человека: кровь, слюну, мочу, кишечный лаваж (смыв) и даже спинномозговую жидкость. В среднем в плазме крови содержится около 4200 метаболитов, в моче — 3000, спинномозговой жидкости — 500, а слюне — 400. Однако для исследования микробиоты в качестве биоматериала используют лаваж.

Процедура исследования метаболитов похожа на анализ белков. С помощью той же жидкостной или газовой хроматографии сначала метаболиты выделяют, а затем измеряют их молекулярную массу с помощью масс-спектрометра.

Исследование метаболитов имеет свои ограничения. Например, на основе этого исследования мы не можем узнать точно, какие метаболиты выделяет именно микробиота кишечника, а какие мы получили с пищей.



Также по нему невозможно подсчитать, сколько тех или иных бактерий содержится в микробиоте. Поэтому для более полной картины данные по метаболитам сопровождаются результатами метагеномных анализов. Такой подход иногда используют, чтобы изучить, как микробиота и ее метаболиты участвуют в развитии заболеваний.

Что нужно запомнить


Пока ни один метод исследования микробиоты не используется в регулярной клинической практике. Иногда для полной картины врач может порекомендовать провести именно метагеномное исследование микробиоты, чтобы оценить состав бактерий кишечника.

Мы предупреждаем пользователей, что тест «Генетика микробиоты» подходит только в образовательных целях и разработан для здоровых людей, которым интересно познакомиться со своими бактериями. Если человек болен, то он сможет узнать состав бактерий, но рекомендации в этом случае будут не актуальны. Микробиота людей с заболеваниями сильно отличается, и для них «нормальный» профиль будет другим.

Мы не советуем проводить исследование детям, потому что по их микробиоте данных намного меньше. А лишнее вмешательство и ограничение рациона детей по результатам исследования — потенциально опасно, так как ребенок может недополучать необходимых нутриентов или пострадать от гипердиагностики.

Сегодня жителям России и стран СНГ предлагают исследование метаболитов микробиоты для детей и взрослых по образцу крови или слюны методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии. По его результатам, как утверждают разработчики этого метода, можно оценить наличие и отсутствие воспалений в организме.

Однако в международных клинических гайдлайнах нет подобных рекомендаций. Диагностика воспалений и заболеваний должна проводиться методами, которые имеют высокий уровень доказательности, определенную степень чувствительности, низкую вероятность ложноположительных результатов и осложнений гипердиагностики.

Остальные статьи о микробиоте кишечника:

  1. Что это за орган и зачем он нам;
  2. Какие бактерии живут в кишечниках россиян;
  3. Как бактерии кишечника влияют на заболевания
  4. Как заботиться о бактериях кишечника
  5. Как лекарства влияют на состав бактерий кишечника
  6. Как работает тестирование
Tags:
Hubs:
+15
Comments 10
Comments Comments 10

Articles

Information

Website
atlas.ru
Registered
Founded
Employees
51–100 employees
Location
Россия