Обнимающий солнце: подсолнухи вместо опиоидов

Организм человека можно без преувеличения считать одним из самых сложных механизмов биологического происхождения. Конечно, так же можно назвать и многих других существ, обитающих на Земле, но мы на их фоне выделяемся наличием интеллекта, несравнимого с чьим-то другим. Мозг человека это и система обработки данных, и хранилище информации, и генератор сигналов в ответ на внутренние и внешние раздражители. Одним из таких сигналов является боль. Когда с каким-то органом или тканями что-то не так, мозг посылает сигнал, предупреждая нас о проблеме, чтобы мы в свою очередь могли предпринять действия для ее решения. Боль бывает разной, очевидно. Как и ее восприятие, то бишь болевой порог. Но, какой бы силы ни была боль, назвать ее приятным ощущением сложно. Посему за многие века развития медицины и фармакологии человечество придумало немало методов избавления от боли, в том числе и обезболивающие препараты натурального и синтетического происхождения. Тысячи лет тому назад человек начал использовать опиум, ставший прародителем опиоидных анальгетиков. Эти препараты весьма эффективны, но обладают рядом побочных эффектов. Посему группа ученых из Венского медицинского университета (Австрия) организовали поиски альтернативы, обнаруженные в очень неожиданном месте — в подсолнухах. Что именно из подсолнухов способно облегчить боль, каковы свойства такого обезболивающего, и как ученые его синтезировали? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых. Поехали.

Основа исследования

Использование опиума насчитывает тысячи лет. Первое упоминание об использовании снотворного мака (Papaver somniferum) датируется 5700–5500 гг. до н.э. в эпоху неолита. Опиум уверенно можно назвать одним из самых древних обезболивающих и наркотиков в истории. Древние греки, египтяне и минойцы использовали его в медицинских целях (и не только). У последних даже есть богиня, головка которой украшена короной из коробочек мака.

В 1804 году Фридрих Сертюрнер впервые извлек из опиума его основное действующее вещество — морфий. А в 1898 году начали применяться его синтетические производные — этилморфин и героин.

Множество работ было посвящено опиуму и его производным. В последствии удалось создать немало препаратов, способных утихомиривать даже самую яростную боль.

Но у всего есть две стороны медали. Для опиоидов положительной всегда была их медицинская польза, а отрицательной — их наркотический эффект. Многие из нас прекрасно понимают, что опиоиды это наркотическое средство, вызывающее зависимость. Это разрушает не только здоровье человека, но и его жизнь, да и жизнь окружающих тоже. Однако сейчас существует не только проблема распространения опиоидных наркотиков, но и кризис злоупотребления опиоидов, отпускаемым по рецепту.

Решение этой проблемы в виде повышения контроля над сбытом подобного рода препаратов, конечно, может иметь положительный эффект, однако полностью разрешить ситуацию не сможет. Посему ученые по всему миру ищут вещества, которые смогли бы стать альтернативой опиоидов, но без их пагубного влияния на центральную нервную систему.

На данный момент рецепторы, связанные с G-белком (GPCR от G protein-coupled receptor), считаются одной из основных целей в разработке лекарственных препаратов. А посему низкомолекулярные лиганды этих рецепторов занимают львиную долю на фармацевтическом рынке.

Проблема в том, что создание пептидных терапевтических средств, нацеленных на GPCR, сопряжена с рядом ограничений фармакокинетики (метаболическая нестабильность, короткий период полувыведения и быстрый клиренс), а также отсутствием пероральной биодоступности* (низкая желудочно-кишечная стабильность и проницаемость мембран).

Биодоступность* — по факту, сколько препарата доходит до места его действия в организме.

Вполне очевидно, что эти проблемы требуют безотлагательного решения. И, как обычно, ученые умы обратились к одному из самых богатых источников вдохновения — к природе. Пептиды природного происхождения стали основой для многих новых препаратов для GPCR, в том числе для лечения желудочно-кишечных заболеваний.

Важной особенностью пептидов растительного происхождения является возможность моделировать мощные лиганды GPCR с улучшенными фармакологическими свойствами. К примеру, широко применяются цистинерические пептиды, обладающие исключительной стабильностью и пластичности. Однако у циклотидных каркасов есть и недостатки. Одним из явных считается порой низкий выход при окислительной укладке, что может привести к высоким затратам на синтез или даже к «неработоспособности» получаемого препарата.

И тут на сцену выходит подсолнух, из семян которого можно получить ингибитор-1 трипсина (SFTI-1 от sunflower trypsin inhibitor-1), представляющий собой циклический пептид с 14 остатками (1A и 1B). Достичь стабильности этой структуры, по словам ученых, можно всего лишь одной дисульфидной связью. Следовательно, такая структура намного проще, т.е. ее легче синтезировать.


Изображение №1

Распространенные на данный момент опиоидные препараты, чаще всего работающие с μ-опиоидными рецепторами (MOR от μ-opioid receptor), обладают рядом побочных эффектов. Более безопасной альтернативой считаются вещества, способные воздействовать на κ-опиоидный рецептор (KOR от κ-opioid receptor).

KOR принадлежит к классу ингибирующих GPCR и активируется эндогенным пептидным лигандом динорфином A (dyn A от dynorphin A). Агонисты* KOR весьма эффективны в борьбе с болью, но нередки и сильные побочные эффекты (сонливость, дисфория, галлюцинации и т.д.).

Агонист* — химическое соединение (лиганд), меняющее состояние рецептора при взаимодействии с ним.

Ученые пришли к любопытному выводу: раз уж KOR-зависимые побочные эффекты в основном возникают за счет его активации в центральной нервной системе, то перенос его активности на периферию нивелирует их. Это было проверено на практике. И да, периферически ограниченные агонисты MOR продемонстрировали отличный обезболивающий эффект, но быстрое развитие толерантности (привыкания) по отношению к таким препаратам сильно ограничивает их применение. Другие же варианты таких препаратов либо имели слабый обезболивающий эффект, либо работали только в определенных системах (органах, тканях), либо требовали исключительно внутривенного введения.

Но не все так печально, ибо в семенах подсолнечника удалось выявить циклический пептидный лиганд, нацеленный на KOR. Каркас SFTI-1 позволил создать стабильные и эффективные лиганды KOR (названые гелианорфинами) с высокой периферической анальгетической эффективностью, подтвержденной тестами на мышах.

Результаты исследования

Исследование радиолигандного связывания выявили значительное замещение [³H]-дипренорфина SFTI-1 в препаратах клеточных мембран HEK293, стабильно экспрессирующих KOR мышей (1C и таблица №1).


Таблица №1

Ученые решили улучшить фармакологический профиль SFTI-1, используя «прививание» (1D), подход, который успешно применялся для разработки других пептидергических лигандов GPCR.

Лиганд* — химическое соединение которое образует комплекс с той или иной биомолекулой и производит, вследствие такого связывания, те или иные биохимические, физиологические или фармакологические эффекты.

SFTI-1 представляет собой мощный ингибитор трипсина, характеризующийся циклизацией основной цепи, структурно отличными петлями (далее называемыми петлями связывания и циклизации) и одной дисульфидной связью. Петля циклизации содержит нативную область циклизации аспарагиновая кислота-глицин (D-G), а связывающая петля включает остаток лизина (K), необходимый для ингибирующей активности трипсина. Ранее проведенные исследования взаимосвязи между структурой и активностью dyn A 1-17 позволили определить, какие его фрагменты критически важны для фармакологической активности.

Ингибитор* — вещество, подавляющее или задерживающее течение физиологических и физико-химических процессов.

Так, N-концевая* «информационная последовательность» (YGGF) важна для связывания со всеми опиоидными рецепторами, а С-концевая* «адресная последовательность» (LRRIRPKLKWDNQ) требуется для эффективности и KOR селективности.

N-Конец* — аминогруппа первой аминокислоты, с которой начинается молекула белка или пептид.

C-Конец* — аминокислота, расположенная на одном из концов молекулы белка или пептида, обладающая свободной карбоксильной группой.

Основываясь на этих данных, было проведено прививание путем включения последовательностей dyn A 1-13 и dyn A 1-8 в обе петли SFTI-1 (1D).

Далее был проведен анализ радиолигандного связывания пептидов в зависимости от концентрации. Гелианорфин-1 замещал помеченный тритием дипренорфин* со значением K_i* 220, а гелианорфин-2 со значением K_i 97 нМ (2А).

Дипренорфин* — неселективный, высокоаффинный агонист μ- (MOR), κ- (KOR) и δ-опиоидный рецептор (DOR).

K_i (от inhibitor constant) или константа ингибитора* — количественная мера компонента питательной среды или продукта метаболизма, что вызывает ингибирование, при которой удельная скорость роста биологических агентов или образование продуктов их метаболизма составляет 50% от максимальной. Также K_i является показателем эффективности ингибитора.

Изображение №2

При этом гелианорфин-3 и гелианорфин-4 связывался с KOR с низким микромолярным сродством, то есть со значениями K_i 3.2 и 2.5 мкМ, соответственно.

Поскольку KOR представляет собой ингибирующий GPCR, активация которого приводит к ингибированию аденилатциклазы и, таким образом, приводит к снижению клеточных уровней цAMФ*, пептиды тестировали с помощью функционального анализа цAMФ.

цAMФ (циклический аденозинмонофосфат)* — производное АТФ (аденозинтрифосфат), выполняющее в организме роль вторичного посредника для внутриклеточного распространения сигналов некоторых гормонов, которые не могут проходить через клеточную мембрану.

Несмотря на наномолярное сродство, гелианорфин-1 и -2 полностью активировали рецептор, но только с Ш, аналогичной таковой у гелианорфина-3 и -4 (2В).

Молярная активность лиганда* — мера активности химического вещества, выражаемая в дозе, необходимой для достижения желаемого эффекта с заданной интенсивности.

Дабы понять, влияет ли размер и последовательность эпитопов* или стереохимия определенных остатков на фармакологические свойства в KOR, а также для дальнейшего улучшения аффинности (силы взаимодействия веществ) и эффективности природного пептидного каркаса SFTI-1, было выполнено прививание dyn A 1-6 и dyn A 1-4 и модифицированных тетрапептидных последовательностей дифеликефалина (CR845).

Эпитоп* — часть макромолекулы антигена, которая распознается иммунной системой.

Независимо от последовательностей эпитопа остаток лизина (K) в связывающей петле был заменен аланином (A) для устранения трипсиновой ингибирующей активности SFTI-1. Данные пептиды были исследованы в экспериментах по связыванию KOR (2С).

Было установлено, что прививание гекса- и тетрапептидов на SFTI-1 не улучшает аффинность связывания в KOR (3C).


Изображение №3

Полученные данные полностью согласуются с проведенными ранее исследованиями dyn A 1-13, в которых было установлено, что удаление семи или девяти аминокислот на С-конце снижает его сродство. Гелианорфины, содержащие биоактивный эпитоп с D-аминокислотами в петле связывания показали наиболее выраженный эффект (2C).

Подробный фармакологический анализ гелианорфина-12 показал, что пептид связывается и полностью активирует KOR при K_i 2.4 мкМ и EC₅₀* 1.4 мкМ.

EC₅₀* — полумаксимальная эффективная концентрация, указывающая на концентрацию лиганда, которая вызывает эффект, равный половине максимального возможного для данного лиганда.

Поскольку гелианорфины, содержащие dyn A 1-13, проявляют наиболее выраженную аффинность связывания в KOR, было решено провести дополнительную модификацию этого эпитопа. В результате полученные модификации показали повышенное связывание с KOR, причем гелианорфин-19 выделяется на фоне других вариантов. В частности, гелианорфин-19 связывается с KOR со сродством 21 нМ (3A), а также активирует KOR с EC₅₀ 45 нМ и E_max (максимальная эффективность) 108% (3B). Кроме того гелианорфин-19 частично вытеснил помеченный тритием дипренорфин из участков связывания MOR и DOR со значениями K_i > 10 мкМ. Это указывает на более чем 200-кратное повышение селективности для KOR (3C). Посему для дальнейших опытов было решено использовать именно гелианорфин-19.

Далее необходимо было определить, насколько эффективно гелианорфин-19 индуцирует рекрутирование* β-аррестина-2* (3D).

Рекрутирование* — процесс отбора клеток для выполнения определенной задачи.

β-аррестин-2* — белок, относящийся к фосфопротеинам и выполняющий функции, связанные с передачей внутриклеточных сигналов.

По сравнению с эталонным лигандом (dyn A 1-13), который полностью рекрутировал β-аррестин-2 с EC₅₀ 116 нМ, гелианорфин-19 лишь частично рекрутировал β-аррестин-2 с E_max 41% и EC₅₀ 1.4 мкМ (3D). Из этого следует, что гелианорфин-19 может вызывать усиленную и пролонгированную анальгетическую активность по сравнению с dyn A 1-13.

Для подтверждения эффективности и стабильности гелианорфина-19 ученые провели с использованием SGF (simulated gastric fluid), т.е. с раствором, имитирующим состав желудка (содержит соляную кислоту, хлорид натрия, а также пепсин и воду; pH 1.2). Анализ выявил, что период полувыведения гелианорфина-19 (t_1/2 = 3.1 часа) значительно превышает оную у dyn A 1-13, который полностью разлагается уже через 15 минут. Это свидетельствует о том, что гелианорфин-19 действительно может долгое время сохранять стабильность и выживать в условиях желудочно-кишечного тракта. Для дополнительного подтверждения этих наблюдений были проведены опыты на мышах, испытывающих кишечные боли.


Изображение №4

В предыдущих трудах была выявлена повышенная функциональная активность KOR при хронической висцеральной гиперчувствительности (ХВГ), связанной с хронической болью в ЖКТ. Потому в ходе опытов оценивалась способность гелианорфина-19 изменять ноцицепцию толстой кишки у здоровых мышей и у мышей с ХВГ (4A-4C). Для этого ученые отслеживали висцеромоторные ответы (VMR от visceromotor response) при различных давлениях колоректального растяжения (CRD от colorectal distension).

Одна доза гелианорфина-19 не влияла на отношение VMR к CRD у здоровых мышей (4A). А вот у мышей с ХВГ наблюдалось значительное снижение этого параметра (4B и 4C).

Также было установлено, что гелианорфина-19 значительно снижал потенциал действия болевых рецепторов толстой кишки, вызванный механической стимуляцией (5А).


Изображение №5

На 5B показано, что дополнительное применение норбиналторфимина (нор-BNI), селективного антагониста KOR, никак не повлияло на работу гелианорфин-19.

Второй, но не менее важной, особенностью гелианорфина-19 является то, что он не влиял на моторную координацию и не вызывал центральной анальгезии. Дополнительные тесты также подтвердили и факт периферического воздействия гелианорфина-19, т.е. он не воздействовал на ЦНС, что обеспечивало отсутствие связанных с ЦНС побочных эффектов.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В данном труде ученые изучили возможность использовать подсолнухи для выделения нового типа обезболивающего, способного конкурировать с опиоидами по эффективности, но лишенного их побочных эффектов.

Вполне очевидно, что лучшим обезболивающим стоит считать то, что действует там, где болит, и нигде больше. К сожалению, большинство высокоэффективных обезболивающих оказывают влияние и на другие системы вне своей компетенции. Опиоиды по праву считают одними из лучших борцов с болью, этого нельзя отрицать. Но они могут вызывать привыкание (т.е. организму требуется большая доза для снижения болевых синдромов). А передозировка такими препаратами имеет серьезные последствия для здоровья, не говоря о высокой вероятности летального исхода.

Следовательно, нужна альтернатива, и авторы рассмотренного нами сегодня труда нашли ее в подсолнечниках. Это растение и раньше использовалось в медицине (чаще в народной) ввиду его противовоспалительных и обезболивающих свойств. В данном же труде ученым удалось определить, какие именно молекулы ответственны за эти свойства. В дальнейшем SFTI-1 (ингибитора трипсина-1 подсолнечника) был усовершенствован путем внедрения в него эндогенного опиоидного пептида. В процессе было создано 19 вариаций на основе оригинальной схемы SFTI-1. И лишь один оказался достаточно эффективным, чтобы привлечь внимание ученых, он был назван гелианорфин-19. Полученное вещество способно бороться с болью в области ее происхождения, не влияя при этом на работу центральной нервной системы.

В будущем предстоит провести еще немало тестов, однако уже сейчас можно сказать, что данная разработка может стать революционной. Нет ничего идеального. Когда мы покупаем какой-либо препарат, в коробке нередко можно найти целый «свиток», большую часть которого занимает список побочных эффектов. Но дабы побороть болезнь или боль, мы готовы мириться с побочками. Данное исследование показывает, что это не обязательно, так как всегда можно найти или синтезировать альтернативу, обладающую такой же эффективностью, но лишенную неприятных (а порой и крайне опасных) побочных эффектов.

Благодарю за внимание, оставайтесь любопытствующими и хорошей всем рабочей недели, ребята. :)

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?