Изысканный ужин из пробирки: 3D-биопринтинг стейка вагю

Сказать, что наука тесно переплетена со всевозможными аспектами нашей жизни, значит ничего не сказать. И дело даже не о процессах и явлениях, которые ежесекундно происходят вокруг нас и внутри нас, а о предметах и устройствах, которые мы используем. Все они в той или иной степени являются результатом каких-то научных изысканий. Когда же о науке, несмотря на ее полезность, говорят в рамках продуктов питания, но мнение общества разделяется. Кто-то считает использование науки для совершенствования или создания новой еды вполне нормальным явлением и результатом естественного техногенного развития нашей цивилизации. А кто-то отвергает прогресс, предпочитая все натуральное и подаренное матушкой природой, с презрением относясь к ученым с их пробирками, химикатами, ГМО и прочими гадостями. А теперь представьте споры, которые может породить результат работы ученых из университета Осаки (Япония), создавших на 3D-принтере стейк вагю, по своей структуре идентичный натуральному. Что стало основой искусственного стейка, как именно он был «напечатан», и какова его польза и ценность для человека? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых. Поехали.

Основа исследования

Вагю это совокупное название группы мясных коров. Их особенность заключается в генетической предрасположенности к интенсивной «мраморности» мяса и высокому содержанию ненасыщенных жиров.



К коровам вагю относятся четыре вида: японская черная, японская коричневая, японская безрогая и японская короткорогая (шортгорн). Как понятно из названий, эти коровы были выведены в Японии примерно в конце XIX века посредством скрещивания аборигенной японской коровы с европейскими и американскими породами. В 1910 году был создан регистр породистого крупного рогатого скота, после чего более не допускалось скрещивание, а новое поголовье выводилось «в чистоте» (т.е. без завезенных пород). Данный вид деятельности очень строго регулируется и по сей день. Каждый из телят, который предположительно относится к породам вагю, проходит тщательный осмотр. Если все соответствует стандартам, то ему выдается документ о происхождении с отпечатком его носа, т.е. этот отпечаток уникален для коров (как отпечатки пальцев для человека).

По данным на 2007 год поголовье коров вагю составляет порядка 1.74 миллиона особей, среди которых более 96% это японские черные.

Главная ценность этих пород (да простят меня вегетарианцы) это, конечно же, их мясо. Мраморное мясо европейских и американских пород — это мясо с многочисленными полосами жира, но у вагю все наоборот — жир, рассеченный полосами мяса. Важно и то, что этот жир уникален по своему составу. В нем содержится большая доля мононенасыщенных жиров (от чего и его мягкость), омега-3 и омега-6. Кроме того, из-за того, что 40% жира — это стеариновая кислота, он не оказывает негативного влияния на уровень холестерина в организме человека. Учитывая вышесказанное, несложно представить, что стоимость такого продукта очень высока.


Внешний вид стейка вагю.

За последние годы изготовление искусственного мяса превратилось из шутки в реальность. В некоторых странах уже сейчас можно купить стейк, изготовленный из растительных белков. Но растительные аналоги мяса не могут полноценно имитировать натуральный продукт. Посему больший интерес в научном сообществе приобрели методы, основанные на использовании материала животного происхождения. С его помощью можно создать искусственный аналог мяса, структура, вкус и текстура которого будет гораздо ближе к оригиналу.

Клетки крупного рогатого скота для выращиваемого мяса в настоящее время могут быть получены двумя способами. В первом необходимо выделить клетки и разделить их по типам: мышечные, взрослые стволовые и мультипотентные стволовые клетки. Затем их можно использовать для культивации.

Второй метод основан на трансформации соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) и их дифференциации в каждый тип клеток. Первичные культивируемые стволовые клетки, особенно мышечные сателлитные клетки, сохраняют свою способность к дифференцировке в течение 10 пассажей* и, таким образом, имеют ограниченное количество делений. Но они все равно безопасны для употребления в пищу.

Пассирование* — отбор небольшого количества клеток для выращивания в другом лабораторном сосуде. Одна операция пассирования клеток называется пассаж.

Создание искусственного мяса с применением стволовых клеток не является чем-то новым. Еще в 2013 году Марк Пост и его коллеги создали котлету в лаборатории из стволовых клеток. А в 2020 году в Сингапуре ресторан «1880» начал продавать бургеры с такими котлетами в составе.

Марк Пост рассказывает о процессе создания котлеты из стволовых клеток.

Однако, как заявляют ученые, создать мясо, чья структура и состав будут идентичные природному аналогу, т.е. содержать жировые клетки и выровненные мышечные клетки, до сих пор является крайне сложной задачей.

Среди различных методов решения этой задачи ученые считают самым перспективным клеточную 3D-печать, особенно метод SBP, т.е. с использованием емкостей (ванн), когда чернила распределяются внутри геля или суспензии с тиксотропией*.

Тиксотропия* — способность субстанции уменьшать вязкость от механического воздействия и увеличивать вязкость в состоянии покоя.

Под действием сил сдвига вязкость геля или суспензии становится низкой, что позволяет распределять чернила, затем вязкость снова растет, когда сила сдвига уменьшается, что позволяет сохранять форму напечатанного продукта. Кроме того SBP позволят решить проблему высыхания во время длительной печати при экструзионной 3D-печати в среде с воздушным интерфейсом.

Мясо стейка имеет выровненную структуру пучков скелетных мышц диаметром от 900 мкм до 2.3 мм (в зависимости от возраста и части тела животного), образованных собранными волокнами скелетных мышц, соединенных с сухожилием для их сжатия и расслабления. Мышечные волокна покрыты базальной мембраной, а мышечные пучки окружены жиром вместе с кровяными капиллярами (1а).


Изображение №1

Соотношение компонентов и расположение мышц, жировой ткани и кровеносных капилляров значительно различаются в зависимости от вида мяса и его происхождения. Например, красное мясо в крупе японской вагю содержит 10.7% жировой ткани, тогда как филе вагю содержит 47.5%. Соответственно, разработка методологии сборки трех типов волокон с желаемым расположением, соотношением и количеством, по мнению ученых, является основой для успешного создания искусственного стейка.

В рассматриваемом нами сегодня труде ученые описывают метод создания искусственного мяса, состоящий из трех этапов:

• сбор съедобных бычьих сателлитных клеток* (bSC от bovine satellite cell) и стволовых клеток, полученных из бычьего жира (bADSC от bovine adipose-derived stem cell) из говяжьего мяса, а также их последующее размножение;
• биопринтинг с гелем (TIP от tendon-gel-integrated bioprinting) для изготовления клеточных волокон и их последующая дифференциация в скелетные мышцы, жировые и капиллярные волокна;
• сборка дифференцированных клеточных волокон для создания искусственного мяса путем имитации гистологических структур натурального аналога (1b).

Клетки-сателлиты* — это стволовые клетки, располагающиеся между клеточной мембраной мышечного волокна и базальной пластинкой миофибрилл.

Поскольку сухожилие является ключевой тканью для выравнивания и созревания мышечных волокон, гели для сухожилий были изготовлены с помощью TIP, чтобы обеспечить их последовательное соединение с волокнами мышечных клеток, вызывая образование выровненных созревших мышечных волокон. В результате с помощью TIP было собрано 72 волокна: 42 мышечных, 28 жировых и 2 капиллярных. В результате эти волокна использовались для создания искусственного стейка диаметром 5 мм и длинной 10 мм.

Подготовка клеточного материала

Клетки bSC были извлечены из жевательных мышц 27-месячных японских черных коров. Затем клетки культивировали до пассажа 3 (P3) для их сортировки, в результате которой были выделены следующие типы клеток: CD31^-, CD45^-, CD56⁺ и CD29⁺.

После посева количество пассажа bSC увеличивалось после каждого отделения клеток путем трипсинизации каждые два дня. Среда для пролиферации содержала не только фетальную бычью сыворотку (FBS) и основной фактор роста фибробластов, но также ингибитор p38 для поддержания потенциала дифференцировки пролиферирующих bSC. Количество bSC клеток во время посева увеличивалось примерно вдвое каждый день до P8, а затем вдвое каждый второй день (2a).


Изображение №2

Дифференцировку индуцировали через два дня после посева путем переключения основной среды на среду для дифференцировки, содержащую 2% лошадиной сыворотки (HS). Клетки иммуноокрашивали антителом тяжелой цепи миозина II (MHC) после пяти дней индукции дифференцировки. Клетки bSC демонстрировали хорошую способность к дифференцировки на этапах от P3 до P7, но с этапа P8 способность значительно снижалась (2b и 2c). Посему были использованы клетки только до пассажа 8 (P8).

Затем была проведена трехмерная культивация с коллагеновыми микроволокнами (CMF) и гелем фибрина для оценки потенциала адипогенной* дифференцировки bADSC в различных условиях среды. Это необходимо, поскольку адипогенез стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ADSC), в 3D-культуре выше, чем в 2D-культуре, а эффективность факторов дифференциации зависит от вида.

Адипогенез* — образование жировых клеток из стволовых.

Липогенез* — преобразование ацетил-КоА (промежуточная стадия метаболизма простых сахаров) в жирные кислоты.

Таким образом, обычные адипогенные факторы человека (инсулин, розиглитазон или троглитазон) были впервые обнаружены с ограниченным липогенезом*, что привело к прямому добавлению свободных жирных кислот (пристановая, фитановая, эруковая, элаидиновая, олеиновая, пальмитолеиновая и миристолеиновая кислоты) в питательную среду.

Далее сравнивались комбинации вышеперечисленных жирных кислот. В результате было выявлено, что более высокий липогенез за счет накопления липидов в цитоплазматических везикулах преадипоцитов крупного рогатого скота наблюдается в среде, содержащей все семь свободных жирных кислот (2d).

Также необходимо было оценить эффект ингибитора активин-подобной киназы 5 (ALK5i) рецептора трансформирующего фактора роста (TGF) типа I (ALK5i), чтобы увеличить липогенеза до достижения состояния зрелых адипоцитов*.

Адипоцит* — тип клеток в составе жировой ткани.

Была проведена оценка нескольких концентраций ALK5i (от 1 до 10 мкМ), в результате чего было установлено, что 5 мкМ ALK5i приводит к более высокому липогенезу (2e). Затем липогенез клеток bADSC постепенно увеличивался между 3 и 14 днями дифференцировки (2f).

Для оценки адипогенеза также были проведены исследования двух адипогенных маркеров PPARγ2 и FABP4. Иммуноокрашивание PPARγ2, одного из наиболее важных факторов транскрипции для дифференцировки жировых клеток, показало небольшую экспрессию внутри bADSC через три дня дифференцировки, которая была обнаружена в ядрах. Спустя 14 дней экспрессия в ядрах была уже не столь заметной, что указывает на более зрелое состояние клеток bADSC (2g). Экспрессия FABP4 наблюдалась в цитоплазме (2g).

Повышение экспрессии маркеров было подтверждено анализом РНК (кПЦР), который выявил значительный линейно возрастающий профиль экспрессии маркера PPARγ2, за которым следует FABP4. Это свидетельствует о зрелом состоянии производных от bADSC адипоцитов (2h).

Ученые отмечают, что лошадиная сыворотка (HS) сыграла важную роль в экспрессии CD31, маркера эндотелиальных клеток, независимо от используемой среды (2i и 2j).

Изготовление тканей

После того как все подготовительные работы, связанные с клеточным материалом, были завершены, ученые приступили к фактическому «выращиванию» самих тканей будущего искусственного стейка. В первую очередь это были мышечные ткани.

Чтобы структурировать отдельные bSC клетки в одну систему (т.е. в волокно), была использована 3D-печать с применением ванны (SBP), содержащей биочернила, распределяемых внутри поддерживающей ванны из суспензии гидрогеля. Такая ванна обеспечивает стабильность структуры по оси z.

В качестве вспомогательных материалов выступили желатин и геллановая камедь. Эти вещества съедобны, их легко удалить (если потребуется) и они биосовместимы с используемыми в синтезе клетками. Поскольку при комнатной температуре желатин это гель, а при 37 °C становится жидкостью, его легко удалить после печати путем непродолжительной инкубации при 37 °C. А гидрогель геллановой камеди растворяется в 50 мМ трис-гидрохлориде (NH₂C(CH₂OH)₃ · HCl) при pH 7.4 и температуре 37 °C.

Сначала проводилась печать биочернилами, содержащими bSC, фибриноген и раствор матригеля в поддерживающей ванне, смешанной с гранулированными частицами желатина (G-Gel) или геллановой камеди (G-GG) и тромбином (видео ниже).

Печать сателлитных клеток внутри ванны с гранулированной геллановой камедью

Печать сателлитных клеток внутри ванны с гранулированным желатином

После подтверждения образования геля с последующим удалением поддерживающих ванн, в течение девяти дней после печати как в G-геле, так и в G-GG наблюдалась высокая жизнеспособность клеток (3a и 3b).


Изображение №3

Когда напечатанное клеточное волокно культивировалось в суспензии, волокно становилось глобулярной (сферической) формы (3c). Далее напечатанное клеточное волокно было помещено на силиконовый каучук и закреплено с помощью игл, скрепляющих оба конца, чтобы выдерживать сокращение клеток (слева на 3d). На девятый день структура напечатанных образцов (внутри G-GG и G-Gel) сохраняла волокнистую природу, но уменьшилась в объеме на 60% в G-GG и на 80% в G-Gel (справа на 3d). Такое уменьшение связано с выравниванием и слиянием bSC клеток, а также ферментативным разложением фибринового геля протеазами, секретируемыми из клеток.

Была проведена оценка выравнивания (3e) клеток, показавшая, что клетки в волокне были ориентированы случайным образом, независимо от типа поддерживающих ванн. Но в случае применения фиксирующих игл клетки в волокне, напечатанном внутри G-геля, были ориентированы анизотропно по сравнению с клетками внутри G-GG (справа на 3e). Разница в степени выравнивания между G-GG и G-Gel возникает из-за нарушения поведения клеток некоторыми остаточными веществами, которые могут существовать внутри или на поверхности напечатанных волокон.


Изображение №4

По словам ученых, важной особенностью модифицированного SBP, названного ими интегрированной биопечатью с использованием сухожильного геля (TIP), является введение гелей сухожилий для закрепления волокон отпечатанных клеток для культивирования. На 4а показан процесс TIP, в котором ванна для печати разделена на три части: сухожильный гель снизу, поддерживающая ванна и сухожильный гель сверху.

В качестве поддерживающей ванны использовался G-Gel, а сухожильный гель состоял из 4% раствора коллагеновых нановолокон (CNF), который имеет обратимый золь-гель переход (от жидкости к гелю) от 4 °C до 37 °C. Для разделения слоев и сохранения структуры были использованы лунки из полидиметилсилоксана (PDMS).

После гелеобразования волокон bSC внутри лунки PDMS (видео ниже) инкубация в течение 2 часов при 37 °C вызвала превращение поддерживающей ванны в раствор и сухожильных ванн в гель. После этого лунки PDMS размещались в питательную среду.

Печать сателлитных клеток с применением сухожильного геля.

Спустя три дня было видно, что волокно сохранило свою структуру и связь с двумя сухожильными гелями (4b и 4c). Также спустя 9 дней была подтверждена и высокая жизнеспособность клеток и высокая степень выравнивания (4d и 4e).

Трехмерное изображение ткани из сателлитных клеток на третий день дифференцировки (зеленый: MHC; красный: актин; синий: ядро).

Экспрессия MHC производного с помощью TIP волокна была относительно ниже, чем в культуре с фиксирующей иглой, но уровень экспрессии мРНК MHC был более чем в 1000 раз выше на третий день дифференцировки по сравнению с клетками bSC до начала синтеза (4е). Также были обнаружены саркомерные структуры, свидетельствующие о зрелом состоянии мышечных волокон (4g).

Далее была выполнена многократная печать для изготовления 25 клеточных волокон bSC в одной большой лунке PDMS (4h и видео ниже).

Печать тканей с помощью TIP.

Первоначально ученые хотели создать в одной лунке одну большую ткань, состоящую из разных типов клеточного волокна. Но впоследствии было решено создать мышечные, жировые и сосудистые ткани отдельно, а уже потом соединить их в одну структуру. Связано это с тем, что каждый тип волокна должен создаваться в среде, которая подходит только для него, т.е. синтез очень индивидуальный.

В ходе создания жировой ткани адипогенез жировых волокон, полученных из bADSC, с помощью TIP был подтвержден уровнем мРНК и экспрессией белков PPARγ2. На 14 день по сравнению с необработанными bADSC клетками экспрессия PPARγ2 и FABP4 увеличивалась в >6 и >40 раз в рамках экспрессии мРНК и в >2 и >2 раза в рамках экспрессии белков (4i и 4j). На изображении 4k показаны целые мышечные, жировые и сосудистые волокна, полученные с помощью TIP.

Трехмерное изображение мышечной, жировой и сосудистой тканей:

Трехмерное изображение мышечного волокна на 4-й день дифференцировки (зеленый: MHC; синий: ядро).

Трехмерное изображение жировой ткани на 7-й день (красный: липид; синий: ядро).

Трехмерное изображение сосудистой ткани на 7-й день дифференцировки (красный: CD31; синий: ядро).

Полученные с помощью TIP жировые и мышечные волокна в рамках количества ДНК, модуля сжатия и содержания воды сравнивали с натуральными. Концентрация ДНК в мышечном волокне, полученном из TIP, не изменялась в зависимости от дня культивирования, в то время как в жировом волокне, полученном из TIP, она увеличивалась по сравнению с коммерческим мясом на 14-й день дифференцировки (4l). Это указывает на пролиферацию и значительное изменение количества клеток в жировых волокнах во время культивирования и дифференциации после печати. Кроме того, было обнаружено, что концентрация ДНК в мышечных волокнах, полученных из TIP, в 6 раз меньше, чем в натуральных волокнах (4l), но этого достаточно, чтобы они считались аналогом натуральных. В рамках содержания воды были обнаружены несоответствия синтезированных и натуральных волокон, но модуль сжатия был примерно одинаков (4m).

Наконец, ученые провели сборку полученных волокон в единое целое, т.е. в искусственный стейк. Чтобы это сделать необходимо было сначала понять, как выглядит коммерческая говядина вагю. Для этого был сделан снимок поперечного сечения стейка вагю с окрашиванием α-актинином и ламинином. Мышечные волокна реагируют на оба, а жировая ткань только на ламинин (слева на 5a).


Изображение №5

Для создания стейка размерами 5 х 10 х 5 мм, учитывая снимки реального стейка вагю, была создана модель, показывающая необходимое количество волокон каждого типа (справа на 5а). Диаметр клеточных волокон, полученных с помощью TIP, составлял приблизительно 500, 760 и 600 мкм. Следовательно, необходимое количество каждого клеточного волокна составляло 42, 28 и 2.

Чтобы различить каждое клеточное волокно, волокна мышечных и сосудистых клеток окрашивали в красный цвет с помощью пищевого красителя, оставляя волокна жировых клеток в белом цвете. После физического наложения клеточных волокон друг на друга, их обрабатывали трансглутаминазой, которая является обычным пищевым сшивающим ферментом. Сам процесс сращивания волокон стейка занимал 2 дня при температуре 4 °C. На 5b показан конечный результат этого процесса, также был сделан снимок поперечного сечения, подтверждающих схожесть с натуральным стойком вагю (5c).

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В данном труде ученые продемонстрировали вполне рабочий метод выращивания мышечных, жировых и сосудистых клеток с последующим преобразованием их в волокна для создания искусственного аналога мяса вагю, отличающегося сложностью своей структуры. Анализ полученного мяса показал, что по многим параметрам оно практически идентично натуральному.

Конечно, стейк из лаборатории пока никто еще не пробовал на вкус, но суть исследования была в проверке самой возможности его создания. И ученым это удалось. Они также утверждают, что их методика не только позволяет создавать аналоги мяса, но и в последующем корректировать их структуру, т.е. делать искусственный вариант лучше натурального с точки зрения содержания жира, мяса и т.д., а также расположения этих волокон.

При должном внимании данная технология может развиться в нечто невероятное, безмерно обрадовав как зоозащитников, так и самих коров, и других животных, чье мясо используется в пищевой промышленности. При этом ярые сторонники мяса не будут оставлены в стороне, так как искусственный вариант при дальнейшем совершенствовании технологии может по вкусовым характеристикам превзойти любой оригинал. Не стоит забывать и о том, что подобные исследования крайне важны в условиях нехватки провизии, наблюдаемой во многих регионах планеты.

Благодарю за внимание, оставайтесь любопытствующими и хорошей всем рабочей недели, ребята. :)

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?