Полимеразная цепная реакция и Владивосток



    В общем, мы тут лазили по Филиппинам и искали хитрые бактерии. Потом поехали в Исландию с химиками, и они рассказали про экспедиции биологов в горы за термофильным бактериями (которые живут около горячих источников) — и оказалось, что вся эта история была нужна для полимеразной цепной реакции. Мне стало дико интересно, какое отношение лаборатория с анализами крови имеет к геотермальному источнику, и сейчас я расскажу вам эту волнующую историю.

    Значит, у нас вчера во Владивостоке Роспотребнадзор и Дальневосточный федеральный университет открыли учебный центр по ПЦР. Я сгонял туда вместе с журналистами и нашёл нормальных безумных учёных, которые всё на пальцах объяснили. Потому что именно это они там и будут делать — учить вьетнамцев и китайцев. В основном — учить бороться с биоугрозой.

    Итак, что такое ПЦР?


    Это история про то, как сделать из одной молекулы ДНК несколько миллионов точно таких же.

    Базово — это реакция из трёх шагов: расплетания ДНК на отдельные спирали, потом поиска и маркировки начала и конца нужных участков, затем достраивания маркированных молекул с помощью полимеразы до полных. То есть это такой симулятор репликации ДНК в нашем организме, только делается в пробирке. И чрезвычайно быстро.

    То есть режем все ДНК на половинки, находим только половинки от патогена, отмечаем их, затем полимераза строит к размеченным пары. Повторяем. Повторяем.

    Современная реакция удваивает количество ДНК в колбе каждые 40 секунд. Точнее, КПД цикла чуть меньше — от 78% до 99%, потому что не всё и не всегда сцепляется в реальном мире.

    Зачем это нужно?


    Если у вас в крови плавает какой-нибудь патоген, то можно построить реакцию именно под него, которая будет амплифицировать (увеличивать количество) его ДНК. В какой-то момент в вареве их станет столько, что можно будет это заметить. И вот тут робот закричит: «Ага, попался!», и в результат попадёт метка «положительно».

    В качестве стартера нам достаточно всего 50 штук молекул на миллилитр в общем случае. Для сравнения, у вируса гриппа даже не в крови, а в слюне пациента с первыми симптомами — около 10 тысяч штук на миллилитр.

    Зачем это ещё нужно?


    Можно сколупать буквально пару ДНК с мумии фараона, мамонта или шкуры тигра и секвенировать его геном. То есть реально полностью считать, потому что из ничтожного количества материала для исследования получится очень много молекул ДНК. Отсюда же и применение в судмедэкспертизе — можно установить, кто из умерших королей кому был сыном. Или по паре молекул слюны на месте преступления найти преступника (прямо Гаттака). Или ещё круче — можно реплицировать молекулы с изменениями, и получится управляемый мутагенез. Но последнее сложно.

    А ещё ПЦР — это та самая реакция, которая меняет социальное поведение общества. Потому что с помощью неё определяется отцовство — можно выделять только разные участки ДНК и оценивать, где и что отличается (и насколько), то есть искать близких родственников. Ну или просто секвенировать и оценивать различия.

    Но дальше речь про диагностику вирусных и бактериальных инфекций — это самое широкое применение. И учат тут во Владивостоке ему.

    Как проходит ПЦР вообще?


    Берём материал, например кровь или ещё что. Аккуратно готовим препарат (обычно берётся 1/3 материала, чтобы на случай ошибок в анализе ещё две дозы оставалось в архиве до конца исследования). Препарат смешиваем с тест-системой. В закрытой колбе помещаем этот «супчик» в прибор для проведения реакции.

    Дальше начинаются циклы расплетания ДНК, прицепления к ней праймеров и выстраивания с помощью полимеразы полных молекул. Современные методы ПЦР в реальном времени предполагают, что нужные метки накапливаются и светятся. Это круто, потому что не надо открывать пробирку для реакции на выделение нужных ДНК-последовательностей. Когда свечение можно регистрировать, принимается решение о том, что искомые штаммы в материалы были.

    Ещё несколько циклов позволяют оценить степень изменения сигнала и построить гипотезу о том, сколько ДНК-молекул было в материале изначально, то есть с достаточной точностью определить концентрацию патогена.

    Откуда праймер знает, к чему цепляться?


    Праймер — это хреновина, которая «прилипает» к тому, что совпадает с его нуклеотидным кодом. Если вам нужен вирус бешенства, нужно секвенировать его геном (точнее, нас интересует начало и конец ДНК) и записать места с двух сторон молекулы, где нуклеотидные цепочки уникальны. И сделать к ним праймеры. Праймеры прицепятся к половинкам ДНК, а сверху уже начнёт работать полимераза.

    К ДНК клеток крови тогда ничего не прицепится, только к бешенству.

    Праймеры бешенства будут цепляться только к бешенству. Чтобы диагностировать вашу коровку на бешенство и грипп, понадобится две дозы крови и две разные реакции.

    Теперь самое весёлое. Нам не нужны точно начало и конец молекулы ДНК для диагностики. Нам надо просто много узнаваемых участков. То есть на полном геноме, например, птичьего гриппа, надо выделить два уникальных фрагмента — начало копирования и конец копирования. Чтобы между ними было то, что можно однозначно опознать как птичий грипп без ложноположительных и ложноотрицательных сработок.

    Дальше в дело вступает математика — надо выделить уникальные для генома места, и так, чтобы они были очень короткими, в идеале — от 15 до 30 нуклеотидов. И чтобы между ними оказалось нужное. Два праймера дают что-то типа хэша от молекулы ДНК, то есть позволяют её описать в 30-60 нуклеотидов.

    В эти минимальные достаточные участки для узнавания и прицепляются праймеры. Если они прицепляются к чему-то ещё — это было плохое нацеливание, и точность падает.

    Так при чём тут горячие источники?


    Дело в том, что реакция идёт при высокой температуре, иначе ДНК не денатурирует. Полимераза при этой температуре обычно ломается. Обычно — потому что конкретно у термофильных бактерий она всё спокойно переживает. Поэтому и были в прошлом веке экспедиции на Камчатку, где геологи искали средства для молекулярной медицины, отстреливаясь от медведей. А в Европе гоняли в Исландию.

    Самое смешное в том, что в 1976 и в 1980 году были публикации про полимеразу (наша и американская), но всем показалось это забавным фактом, и практического применения не нашли.

    Теперь дальше. Оказывается, Taq-полимераза из Thremus aquaticus работает по протоколу типа UDP, то есть без коррекции ошибок. Вообще. Собирает что получится — и сношайтесь там дальше сами. Зато быстро.

    Выделили Pfu- и Pwo-полимеразы из архей — они работают с коррекцией ошибок, то есть не дают мутации в процессе репликации (ладно, почти не дают), но зато действуют куда медленнее.

    Раньше запасы этой жажи черпали прямо у источников, сейчас полимеразу разводят в лабораториях. И делают хитрую смесь из Pfu, Pwo и Taq — получается молниеносно быстро и относительно правильно.

    Как это выглядит в реальном мире


    В реальном мире у вас есть коробка тест-систем с интригующей надписью «сифилис», например. Или «грипп». Внутри одной тест-системы — все компоненты для ПЦР, кроме матрицы ДНК, то есть крови пациента. Или другого его куска, где ищется патоген.

    Дальше надо смешать кровь и тест-систему, много раз нагреть и остудить под давлением, а катализатор, праймеры, полимераза и вспомогательные компоненты сделают всё сами. На выходе — пробирка с 10 в двенадцатой молекулами ДНК на миллилитр.

    А можно сделать на кухне?


    В теории. Сам прибор очень простой, вся наукоёмкость в тест-системе — и немного софте, регистрирующем изменение светового сигнала метки. Ещё нужна точность по температуре от 0,1 градуса и программы по её изменению. Плюс фотосенсор. То есть железо не очень сложное. Поэтому этих лабораторий так много — их реально дёшево разворачивать.





    Но вот на кухне сделать не выйдет, потому что самая стрёмная история — это контаминация образца (загрязнение). Протоколы чистоты — это то, чему обучают больше, чем самой реакции. Если одна из результирующих пробирок с ДНК патогена разобьётся в лаборатории, всё будет покрыто ровным слоем ложноположительного результата. То есть все текущие анализы — сразу лесом, потом долгая очистка, проверка, потом доставание архивной крови и снова запуск линии.

    Ну и это, напоминаю, что ДНК патогена и сам патоген — это разные вещи, как исходник и скомпилированный код. И опасность от того, что вы разбили пробирку с 10 в двенадцатой ДНК возбудителя туберкулёза примерно такая же, как рассыпать по полу пачку листов исходника софта запуска ядерной боеголовки.

    4-7% результатов могут быть ложноположительными из-за неаккуратной работы и особенностей реального мира. Поэтому выполняется тщательная проверка достоверности результата, в частности, с помощью математических методов.



    Ещё вместе с обычными материалами ПЦР подвергают тестовую пробирку с водой. Если там что-то начинает амплифицироваться — лаборанту оторвут руки по самые гланды.


    Это не сейф, это шлюз для передачи материала в лабораторию. Персонал в лабораторию передают в чистую зону после душа, переодевания и ещё пары унижающих человеческое достоинство процедур.

    Как можно понять, что с реакцией что-то не так?


    По характеру её развития. Обычная реакция начинается вяло, потом фаза экспоненциального роста, потом в районе последних циклов — выход на плато. Количество ДНК не увеличивается с новыми циклами по десяткам причин от истощения праймеров до завершения одного из ресурсов, накапливаются пирофосфаты. Плюс рядом в супе плавают половинки ДНК, которые не прореагировали раньше, и лезут обниматься ко всем. В результате можно определить артефакты и нетипичный ход реакции — это уже делает софт для небольшого дата-майнинга. Отечественный, бесплатный, регулярно обновляемый, но не опенсорсный.

    А зачем вообще нужно увеличивать количество ДНК в препарате, если всего-то надо совершенствовать методы детекции?


    Есть и такой путь развития. Физико-химические методы совершенствуются, но пока недостаточно. Последний опыт — брали плазму крови, центрифугировали, «тяжёлые» вирусы выпадали на дно пробирки. Дальше их поджаривали лазером масс-спектрографа. Нифига. С колониями бактерий работает (уже давно делают в московских лабораториях на потоке), а вот с вирусами нет. И колонию ещё надо вырастить. Поэтому пока (и, похоже ближайшие лет десять) ПЦР будет самой быстрой штукой для анализов.

    Кстати, полный анализ делается примерно 45 минут (с подготовкой материала), то есть полдня cito или 4 дня, если лаборатория в городе, а вы в селе.

    Ещё для части инфекционных заболеваний концентрация вируса крайне мала. Например, был случай по энцефалиту — клиницист увидел очаговую симптоматику (поражение ЦНС), взяли кровь — даже по ПЦР ещё ничего нет, а антитела уже развёрнуты. То есть ПЦР дала бы результат позже анализа антител, а масс-спектрография — ещё позже, она пока на порядки менее точна, чем ПЦР.

    То есть амплифицируется только один конкретный геном?


    В обычном случае — да. Находится самый современный штамм заболевания, актуальный для региона, и праймеры нацеливаются на его ДНК. Но это немножко утопичная ситуация, потому что одновременно надо искать сразу штук шесть разных штаммов. Для этого в набор добавляются разные праймеры, плюс делается ещё ряд изменений. Естественно, тест-система получается дороже. Либо надо делать несколько реакций под разные возбудители.

    Можно так размножать РНК?


    Да, только нужно из неё делать ДНК. Реакция более сложная, но интересная тем, что позволяет отделять мёртвые клетки от живых. ДНК невероятно прочная, поэтому её можно отколупать даже от мамонта. Если вирус уже перебит, ДНК его дохлых образцов будет «светиться» ещё 3 недели. А РНК рассыпятся куда быстрее. Поэтому NASBA-методы (поиск РНК-вирусов, например) куда точнее в ряде случаев. Но и куда дороже.

    Ещё пара красивых штук


    Вся история имплементации ПЦР после изобретения теории — это прямо хитрые физико-химические задачи. Например, можно амплифицировать неизвестные участки ДНК. Для этого молекулу режут по известному участку, потом склеивают обрезки. Некоторые переворачиваются, и получаются молекулы с известным кодом в начале и конце. Цепляют праймеры — и на тех, где есть начало и конец, а не один маркер, проводится амплификация.

    Очень забавная история с тем, как избежать ненужных шагов реакции при нагреве пробирки. Дело в том, что первая часть реакции идёт при высокой температуре, но пока пробирка греется, можно случайно начать не с того такта — это резко повысит шум и вероятность ошибки. Поэтому от вариантов с тем, что один из реагентов системы кладётся в восковую капсулу (она плавится только после прохода через нужную точку и освобождает компонент вовремя) пришли к варианту, когда в раствор добавляется вещество, которое блокирует реакцию, но разрушается при высокой температуре.

    Есть защита от загрязнения — молекулы на амплификации можно маркировать определённым образом, а потом в начале реакции уничтожать все маркированные так. То есть если что-то из одной пробирки переползло в другую, его автоматом завалят до основных реакций.

    С флуоресценцией тоже круто: в реагенты кладётся вещество, которое разрушается в результате реакций с ДНК. То есть чем больше ДНК образуется, тем больше молекул этого вещества разламывается. Целое оно не светится, а кусками — начинает. И вот чем больше молекул ДНК реагируют при репликации, тем больше светится пробирка.

    С учётом, что сложность тест-систем растёт, лайфхаков и элегантных решений море.

    Зачем нужно делать центры обучения ПЦР при университетах?


    Потому что это пока главная история про диагностику заболеваний, причём не обязательно у людей. Здесь, на Дальнем Востоке, например, фокус может быть и на фитовирусах. Есть в закромах Родины бинарный вирус спецом для риса (точнее, два хорошо сочетающихся вируса), которые могут взять и положить нафиг весь урожай по Азии при распространении. Естественно, такая штука есть не только у нас — и не обязательно он будет выпущен злонамеренно, может развиться по идиотизму или просто в природном очаге. Как японский энцефалит в Приморье — тут постоянно возникают сезонные очаги у комаров. А смертность от него — 60 процентов.

    Ещё у предполагаемого противника есть вирусы на животных и людей.

    Так вот, спецы по ПЦР представляют биобезопасность страны. Они мониторят инфекции, вылавливают всех пассажиров самолёта, где кое-кто не тем кашлянул и так далее. Михаил, например, летал на эболу, на оба птичьих гриппа и ещё много куда. Он же секвенировал полный геном единственной живой копии вируса медвежьего бешенства в мире.


    Михаил Щелканов, профессор ДВФУ, завлаб вирусологии ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН.

    С медведем вообще офигенная история. Мишка задрал 5 собак и потом напал на бабку. Он ей лёгкое вывернул и скальп снял, плюс обслюнявил всю и залил кровью. Про зверя охотоведы решили, что это какой-то неправильный медведь. И отдали его остатки учёным на опыты. Вот тут больше деталей.

    Ещё Михаил фанат морских котиков, потому что обожает острова с лежбищами. На них крайне быстро передаются на всю популяцию вирусы и паразиты. Они нашли у котиков в ноздрях крутую вшу с не менее крутыми бактериями. Тюлень когда ныряет, он ноздри схлопывает. Вша внутри чувствует себя тепло и прельстиво.

    Кроме биобезопасности вторая история — обучение иностранных специалистов. Тут две важных вещи: во-первых, они учатся на наших тест-системах (и потом будут с большей вероятностью закупать их), а это важно для экспорта — мы лидеры по СНГ (примерно 25 миллионов реакций в год), но не по миру. Во-вторых, одинаковость опыта позволяет одинаково мониторить по общим протоколам, то есть потом меняться базами данных и опытом. Базами, конечно, важнее. Это означает куда более согласованную реакцию на возможные эпидемии.


    Во Владивостоке официальное открытие не совпало с техническим — уже последние уроки добивает группа вьетнамских врачей. Двое знают русский, остальные учатся через них. Есть полностью английский курс. Такой же центр работает в Новосибирске для российских врачей и врачей из стран СНГ, и там уже год выпускают спецов.

    Ещё мы для наших тест-систем сейчас делаем всё в России, и в практической молекулярной биологии одни из самых сильных в мире (в теории — нет, но мы быстро и инженерно-творчески всё внедряем). Поэтому образование поможет расширять этот рынок для нас же. Всего в таких центрах подготовлен 3881 специалист (маленькие группы, потому что много практики), и сейчас задача широко выйти на обучение зарубежных спецов.

    Полностью это называется Международный учебный центр Роспотребнадзора при Школе биомедицины Дальневосточного федерального университета. Открывали его, собственно, Михаил Щелканов с фото выше и Герман Шипулин (ФБУН ЦНИИ Роспотребнадзора в Москве). Пруфы в СМИ будут завтра, видимо. Ну и я не микробиолог, поэтому если где-то выше ошибся — попрввьте, пожалуйста.

    UPD: вот новость на RG, в которой есть ещё точка зрения на эту историю.
    Поделиться публикацией
    Похожие публикации
    Ой, у вас баннер убежал!

    Ну. И что?
    Реклама
    Комментарии 59
      +1
      Я, кажется, не глядя на авторство, по одному только названию статьи научился определять «made by Milfgard».

      Спасибо за статью!
        +1
        Спасибо за статью.
        Ну и это, напоминаю, что ДНК патогена и сам патоген — это разные вещи, как исходник и скомпилированный код. И опасность от того, что вы разбили пробирку с 10 в двенадцатой ДНК вируса турберкулёза примерно такая же, как рассыпать по полу пачку листов исходника софта запуска ядерной боеголовки.
        Какое чудесное сравнение!
        Всего в таких центрах подготовлен 3881 специалист (маленькие группы, потому что много практики), и сейчас задача широко выйти на обучение зарубежных спецов.
        Т.е. 3881 — это почти все наши? Зарубежные только сейчас появляются?
        А сколько вообще таких центров по стране и где они есть?
          +2
          Это наши в большинстве, немного из СНГ, единицы не из бывшего СССР. Про центры я сейчас позову на Хабр Жанну из их отдела по связям с общественностью. Учёные дорвались и держат такой темп публикаций, что им вообще сейчас ни до чего.
            0
            Привет! Не только наши, обучение в центре прошли 250 иностранных специалистов. Всего таких центров 5 (с Владивостоком). В Москве, Санкт-Петербурге, Екатеринбурге, Новосибирске.
              +2
              Судя по географии не хватает где-нибудь в Ростове-на-Дону))

              Ну здорово, что сказать… Надо о таких вещах рассказывать. Я бы в школе о таком услышал — мог бы и не в математику, а в биологию/химию пойти…
                0
                Судя по тому, что я знаю, не хватает в Минске, где-то в Казахстане и в Киеве (но там деплой пока затруднён).

                И про математику вы зря. Она у микробиологов сейчас в ДВФУ профильная. И в курсе General Medicine тоже сильная.
                  +1
                  И про математику вы зря.
                  Я не в этом смысле, а как раз наоборот)) Если бы я в школе о таком услышал, я бы заинтересовался биологией в дополнение, а не вопреки математике. Т.е. чистый матан поменял бы на матан+химбио.
                  0
                  Наверное будет и в Ростове. Как озвучил Герман Шипулин на брифинге, в ближайшем будущем планируются открытия таких центров в Беларуси и Казахстане.

                  Будем рассказывать обязательно. Мы недавно запустили крутейший информационно-научный портал, посвященный молекулярной диагностике. если есть пользователи, причастные к науке и медицине, welcome www.pcr.ru
                    +1

                    Аналогичное чувство. Биология нравилась, но всегда казалась закрывшейся наукой. А так-то это наука будущего. Сейчас проектируют и кодят железки, в будущем будут проектировать мясо:)

                      0
                      Мне казалось, что это наука далёкого будущего, а оказалось, что совсем наоборот…
                +1
                На первом фото какой-то термостат?
                  0
                  Амплификатор «Терцик».
                    0
                    Значит я правильно его опознал, по сути это и есть узкоспециализированный термостат.
                      0
                      Ну как, термостат с фичами. И интеграцией с софтом. Ещё у них есть «Термо 24» прямо рядом.
                        0
                        А серебристый прибор под фото с красным держателем пробирок, это что? У меня нет вариантов :)
                        0
                        Интересный форм-фактор блоков. Они совместимы с центрифугами? Можно было бы вытащить блок, вставить в центрифугу и отфуговать конденсат на дно пробирки.
                        +1
                        Если быть точным, это термоциклер для амплификации.
                        А серебристый прибор это амплификатор в режиме «реального времени» т.е. термоциклер и детектор флуоресценции в одном флаконе.
                    0
                    Можно ли простыми словами, но поподробнее о самой технологии.
                    Например циклы нагрева охлаждения.
                    Из чего состоят реактивы? Как их синтезируют.
                    Что считывает светодиод (детектор), почему и как светиться препарат.
                    Почему при ПЦР искомая ДНК вируса множиться, а человеческая (из слюны или крови — нет)?
                      0
                      Здесь почитайте: habr.com/post/48533
                        +2
                        Могу порекомендовать книгу «ПЦР в реальном времени» за авторством Ребрикова, Саматова, Трофимова и др. Там все очень подробно.
                        К слову, это «авторы» этого ветерана с первого фото (впервые выпущен, если не изменяет память, в 98-ом) и современного, весьма конкурентоспособного с импортным, оборудования.
                          +14
                          Общий принцип простыми словами объяснить можно, но коротко не получится.
                          Заранее извиняюсь, за фактические ошибки, мог забыть какие-то детали, пытался описать суть.
                          ПЦР — это просто реакция копирования ДНК, это конечно, хорошо, но хочется гораздо большего, поэтому существует over 9000 методов, построенных на базе ПЦР.
                          Например, определение количества патогена это реакция «ПЦР в реальном времени», и даже разновидностей «ПЦР в реальном времени» over 9000 с разными реагентами и т.п.
                          Для проведения определенной реакции не надо знать всего-всего про ПЦР, лаборанты действуют по четкому алгоритму соответствующему конкретному методу, знают, что надо сделать 1-2-3, и получится результат, причем большую часть делает аппаратура и ПО.

                          Для начала надо понять, что такое ДНК.

                          Есть 4 вещества: аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г) и цитозин (Ц). Можно каждому сопоставить цифру, например. А потом, соединив последовательно в порядке, каком мы захотим закодировать что-то. Например: «АТТГЦЦТА».

                          Но ДНК состоит из двух цепочек, которые, как говорят «комплиментарны». Это значит, что на второй цепочке всегда напротив аденина — тимин, напротив гуанина — цитозин. Т.е вторая цепочка всегда однозначно соответствует другой цепочке.

                          При нагревании спираль ДНК разъединияется на две цепочки, при охлажении — конденсируется, т.е две цепочки обратно соединяются.

                          Как я уже говорил, ПЦР — это реация копирования ДНК, но чтобы скопироваться, нужна «затравка». Покажу на примере.
                          Есть ДНК

                          АЦЦТГАТЦГА
                          ТГГАЦТАГЦТ

                          при нагревании до 94-96 градусов (фаза денатурации) она, разъединяется, первая цепочка

                          АЦЦТГАТЦГА

                          Но её скопировать нельзя, т.к нужна затравка, затравка это несколько уже готовых элементов второй цепи:

                          АЦЦТГАТЦГА
                          ТГГА

                          вот такую скопировать можно.
                          Где взять затравку? Обычно затравка это известная последовательность, которая присутствует в каком-то патогене и только в нем. Эту затравку называют «праймер».
                          Откуда берут эту последовательность? Лаборатории их покупают у специальных компаний, которые их изготавливают. А изготавливают их химически, за каждую «буковку» по «рублю», поэтому последовательность длинной 10 символов синтезировать можно, и не очень дорого, а целиком ДНК, например, человеческий очень дорого, да и на самом деле чем длинней цепочка, тем хуже идет химический синтез, т.к раствор «замусоревается». Есть способы обхода, но это отдельный разговор.

                          Праймер этот при понижении температуры до 68 градусов сам найдет нужный участок цепочки ДНК и присоединится.

                          Теперь про синтез.

                          Синтез происходит с помощью специальной биологической молекулы, которая называется taq-полимераза, которую изначально выделили из специального вида бактерии.

                          Эта бактерия выхватывает А, Т, Ц, Г из раствора и присоединяет по одной букве, при примерно 72 градусах.

                          Где берут лаборатории эту полимеразу? Тоже, покупают. Промышленное производство taq-полимеразы — отдельный, сложный вопрос. И занимаются этим специальные компании. Можно её выделять из бактерии и очищать. Можно производить её с помощью генной инженерии, т.е научить другую бактерию прозводить её и.т.п. Как точно сейчас это делают — не вкурсе. Кстати, производителей, тоже, много и видов полимеразы, тоже много, есть более точные, есть менее точные, отличаются множество других характеристик.

                          Вот в этом и заключается ПЦР.

                          Заметьте, ничего о считывании и о свечении я не писал. Потому что в базовой реакции ПЦР ничего не светится.

                          Но гораздо полезнее, например, если можно будет посчитать количество патогена. Для этого в раствор добавляют специальный реагент, и при присоединении какой-то определенной буквы этот реагент будет светиться. И чем больше было ДНК изначально, тем больше будет его и в конце, и тем больше света мы увидим.

                          — Вопросы:
                          1. Например циклы нагрева охлаждения.
                          Этап 1: 92-95 градусов: денатурация: разделение спирали днк на две цепочки
                          Этап 2: 68 градусов: отжиг: присоединение праймеров к цепочкам
                          Этап 3: 72 градуса: копирование ДНК с помощью taq-полимеразы

                          Затем все повторяется несколько раз.

                          Устройство, в котором проводят реакцию называется «амплификатор, оно достаточно простое, и не дорогое по сравнение с другим оборудованием для биотехнологий, фактически это термостат, который управляются с компьютера со встроеным светодиодом. Если не ошибаюсь, можно купить тысяч за 100 рублей.

                          2. Из чего состоят реактивы? Как их синтезируют.

                          А, Т, Ц, Г, taq-полимераза, праймер. Лаборатории их покупают у спец. фирм.

                          Что считывает светодиод (детектор), почему и как светиться препарат.

                          Считывает количество света. Светится, т.к в растворе плавает спец. реагент.

                          3. Почему при ПЦР искомая ДНК вируса множиться, а человеческая (из слюны или крови — нет)?

                          Потому что „праймер“ соответствует вирусной цепочке, а а в человеческой цепочке такого кода нет, праймер специально так подбирают, чтобы в вирусной ДНК такой код был, а в человеческой — нет.
                            0
                            Но её скопировать нельзя, т.к нужна затравка, затравка это несколько уже готовых элементов второй цепи:

                            А почему копирование не происходит без праймера?

                            Т.е. taq-полимераза просто добавляет комплиментарные буквы где попало или оно всегда добавляет комплиментарную букву к концу уже существующей цепочки? Если второе, тогда понятно зачем нужны праймеры.
                              0
                              Почему не происходит без праймера — это надо спросить природу.
                              Кстати, википедия подсказывает, что любое удвоение ДНК всегда происходит с праймером, что это не какой-то такой особый экзотический механизм из экзотической бактерии, а удвоение так происходит всегда.
                              К концу уже существующей цепочки. step-by-step по одной букве.
                                0
                                А есть ограничения на длину праймера? т.е. будет ли работать праймер длиной в 1 букву? Понятно, что нет пользы практической в 1буквенном праймере, но интересен сам механизм.
                                  0
                                  Одна «буква» не будет надежно держаться за матричную цепь, водородные связи, обеспечивающие комплементарность, не очень прочные. Обычно праймеры около 20 «букв», это уже вполне прочная связь.
                          +1
                          Ба, сколько знакомых слов :) праймеры, ПЦР, амплификация…
                          Реквестую пост про ИФА — там не менее интересно, только железо стоит как чугунные мосты.
                            0
                            Или по паре молекул слюны на месте преступления найти преступника

                            Насколько дорога данная технология? Сколько, например, человеко-часов и/или денег будет стоить такое исследование?
                              +2
                              ни насколько, очень наглядно демонстрирует почему — ситуация с ватными палочками, которыми собирали биоматериал на местах преступлений в Германии, если не ошибаюсь… несколько лет искали мифического маньяка, совершившего сотни преступлений, а им в итоге оказалась фасовщица тех палочек на заводе, которая пользовалась перчатками из бракованной партии в результате чего ее биоматериал на палочки попадал… а теперь представьте сколько ложных срабатываний будет на выборке в пару молекул… особенно в общественных местах, где эти молекулы могло принести за пару сотен метров.
                                +1
                                Несколько лет назад мне рассказывали, что лаборатории МВД используют ПЦР только в «резонансных» случаях. А для повседневного использования — дорого.
                                0
                                У нас в Харькове в испытательной лаборатории «АГРОГЕН НОВО» уже давно ПЦР используют в разных направлениях. В растениеводстве, в основном сельскохозяйсятвенные культуры, так как большой объём и в ветеринарии.

                                Сайт: agrogen.com.ua
                                  0
                                  «Ещё вместе с обычными материалами ПЦР подвергают тестовую пробирку с водой» — вроде бы все компоненты должны в пробирку класть, кроме собственно анализируемой ДНК. И ничего амплифицироваться не должно.
                                    0
                                    Так об этом и речь. Если начало — это индикатор загрязнения.
                                    0
                                    И опасность от того, что вы разбили пробирку с 10 в двенадцатой ДНК вируса турберкулёза примерно такая же, как рассыпать по полу пачку листов исходника софта запуска ядерной боеголовки.

                                    Но ведь туберкулёз (кстати опечатка в названии) вызывается микобактериями?...


                                    Чтобы диагностировать вашу коровку на бешенство и грипп, понадобится две дозы крови и две разные реакции.

                                    Но ведь коровье бешенство — прионная болезнь, т.е. вызванная белками неправильной третичной структуры, которые катализируют неправильное сворачивание у других таких же белков. Так что по идее анализом на ДНК/РНК её не диагностировать.

                                      0
                                      1. Да, мой косяк, сейчас поправлю.
                                      2. Бешенство и корвье бешенство — это два разных заболевания. Первое вирусное.
                                      0
                                      Ну и ещё немного про ПЦР простыми словами
                                      www.youtube.com/watch?v=x5yPkxCLads
                                        0

                                        Если праймеры — хеш от ДНК, то зачем после процесса проводить анализ на ДНК, если можно посчитать количество праймеров?

                                          0
                                          Они позволяют полимеразе продублировать молекулу ДНК. Пока молееул мало, всё равно непонятно, к чему они прицепились.
                                            0
                                            Праймеры это не то чтобы хэш.
                                            Это максимально короткая последовательность ДНК которая присутствует в патогене, но которой нет в человеческой ДНК.

                                            Что значит посчитать количество праймеров?
                                            Было 1000 праймеров и 10 патогенных ДНК, после гибридизации стало 990 праймеров плавать в растворе (10 присоединилось к патогенному ДНК), таким образом можно сделать вывод по числу 990, что патогенных ДНК было изначально 10. Так что ли?

                                            Как посчитать количество праймеров? Их не посчитаешь.
                                              0
                                              Не совсем. Было 1000 праймеров и 10 ДНК. После гибридизации стало 990 праймеров.
                                              Потом прошла гибридизация, и еще раз, и еще. Стало 1000 ДНК и 0 праймеров.
                                              Посчитали праймеры — сделали вывод о наличии/отсутствии конкретной ДНК в исходном растворе
                                            0
                                            «В какой-то момент в вареве их станет столько, что можно будет это заметить. И вот тут робот закричит: «Ага, попался!», и в результат попадёт метка «положительно». » — я правильно понял, что по «итогу» реакции должно быть свечение, что подтвердит, что размножили именно то, что искали? Или есть какие-то другие «роботы», кроме люминесценции? Или я вообще ничего не понял, тогда извините.
                                            Т.е. если не знать, что ищем — то и мал шанс, что найдем?
                                              0
                                              Фотосенсор устройства смотрит на то, как светится пробирка. Он (вместе с софтом управления) — тот самый робот, который поставит вам результат в анализ. Ещё он замеряет свечение по интенсивности изменения по циклам, чтобы сделать полуколичественный результат. Полу — это к тому, что точность у такой оценки около порядка.
                                                0
                                                А почему свечение начинается только когда нужное днк расплодилось? Т.е. светится то какое-то другое вещество, которое и раньше было в растворе. Или оно светится только когда как-то соединяется с днк? Можно чуть более детально описать этот механизм?
                                                  +1
                                                  Способов много, они все разные. Самому пришлось гуглить )
                                                  image
                                                  Вещество А от света частоты Fa активируется и может передать энергию активации веществу Б, которое в свою очередь испустит свет частоты Fb.
                                                  Это если они находятся близко, если они прицепились соседями при сборке цепочки ДНК.
                                                  А если они плавают в растворе, то вещество А не передает энергию веществу Б, соответственно мы светим в раствор с частотой Fa, и не видим в ответ света с частотой Fb, а если полимераза их прицепила соседями, то свет частотой Fb видим.
                                                    0
                                                    Интересно! Спасибо за обьяснение!
                                                0
                                                Да, поиск заточен на какую-то определенную последовательность ДНК. Нельзя «просто искать». Например, можно искать ДНК код, который есть в ДНК стафилококка, но нет в человеческом ДНК.
                                                +1
                                                вот совсем никакого отношения к теме не имею, но читается очень легко. спасибо

                                                забавно получилось
                                                Михаил, например, летал на эболу, на оба птичьих гриппа и ещё много куда.
                                                … Мишка задрал 5 собак и потом напал на бабку


                                                  +1
                                                  Спасибо за статью, оч. интересно.
                                                  А можете ещё пояснить этот момент:
                                                  Для этого молекулу режут по известному участку, потом склеивают обрезки.

                                                  Как технически происходит «резка» ДНК в нужном месте?
                                                    +1
                                                    Тоже с помощью специальных белков, которых изначально выделили из живого организма.
                                                    Способов множество.
                                                    Сначала открыли эндонуклеазы рестрикции, к примеру эндонуклеаза EcoRI режет всегда так
                                                    image
                                                    В последнее время все носятся с CRISPR / CAS9, там можно резать по любой желаемой для исследователя последовательности. Но изготовить реагенты стоит денег не малых.
                                                    На самом деле и до CRISPR / CAS9 была масса способов резать ДНК, цинковые ножницы например, и далее появляются новые способы разрезать ДНК. Они различаются точностью, ценой, получаемым результатом.
                                                    Так что ответ на вопрос «Как технически происходит «резка» ДНК в нужном месте?», будет вопрос «Вам какой из способов описать?»
                                                    0
                                                    Бабку-то жаль. Несчастная женщина. Не выжила?
                                                      0
                                                      По ссылке выше в течение 10 дней выжила. По ещё ряду более поздних — нет.
                                                      0
                                                      Статья оставила впечатление, что отсутствие в 2018 году живого мамонта обусловлено в первую очередь тем, что он на самом деле никому не нужен.
                                                        +1
                                                        Ну, у нас есть его исходники. Теперь нужен компилятор. Пара библиотек. Ну и хотя бы понять, на каком языке он написан.
                                                        +1
                                                        ПЦР… знакомые, блин, буковки. Сколько времени и нервов потрачено на получение данных по этим тестам с программ, а до сих пор косяков куча)
                                                        В основном, кстати, проблемы связаны с тем, что наши делают под наш рынок и не очень то изначально думали про мировой с его английским по умолчанию, поэтому на выходе легко получаются бланки на английском, в которых часть подзаголовков на русском.
                                                        А в свою ЛИС ты забрать данные сможешь не все — выводы они только в своём бланке выдают, а не в XML файле с прочими результатами.
                                                        Короче, наблюдается стандартная болезнь связки предприятий с IT-подразделениями и низким уровнем постановки и/или реализации задач, которая характерна для многих в РФ…
                                                          0
                                                          Кстати, уточню, что кроме описанного определения вирусов, по технологии ПЦР проводят ещё и генотипирования (например на риск аутоимунных заболеваний, совместимость пар), определение BRCA-мутаций (наличие которых повышает риск рака молочной железы, яичников, предстательной железы) и прочие генетические исследования.

                                                        Только полноправные пользователи могут оставлять комментарии. Войдите, пожалуйста.

                                                        Самое читаемое