Перелом кости является одной из самых распространенных травм, которые чаще всего довольно легко лечатся без необходимости в хирургическом вмешательстве или использовании специальных металлических, костных или керамических имплантов. Однако в особо тяжких случаях без этого не обойтись. Как и любое другое инвазивное вмешательство, подобное лечение сопряжено с рядом рисков как в процессе вмешательства, так и во время восстановительного периода. Ученые из Швейцарской высшей технической школы Цюриха разработали гидрогелевый имплант, состоящий на 97% из воды и изготавливаемый с помощью лазера, который может стать крайне эффективной заменой классических имплантов для лечения сложных переломов. Как изготавливался этот имплант, как именно он работает, и насколько он эффективен? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.

Основа исследования

Двухфотонная полимеризация (2PP от two-photon polymerization) — это метод прямой лазерной записи для создания высокоразрешенных 3D-гидрогелевых структур в тканевой инженерии и доставке лекарств. Эта технология 3D-печати позволяет создавать гидрогелевые структуры с разрешением в (суб)микронном масштабе. 2PP использует фемтосекундные лазерные импульсы для локального затвердевания в фоточувствительном растворе-прекурсоре, что позволяет напрямую записывать сложные 3D-структуры. Нелинейный характер двухфотонного поглощения ограничивает фотохимическую реакцию фокальным объемом лазера, обеспечивая превосходный пространственный контроль по сравнению с традиционными методами однофотонной фотолитографии.

Хотя 2PP показала перспективность в создании гидрогелей, имитирующих внеклеточный матрикс (ECM от extracellular matrix), она сопряжена с рядом проблем при выборе подходящих базовых материалов. Ключевая проблема заключается в объединении биосовместимости, биоразлагаемости, водорастворимости и высокой фотореактивности в одной рецептуре для эффективной 2PP. Недавние достижения свидетельствуют о разработке водорастворимых двухфотонных фотоинициаторов, клеточно-совместимых прекурсоров гидрогелей, таких как виниловые эфиры желатина, и новых механизмов (де)сшивания. В частности, сообщалось о серии водорастворимых циклических фотоинициаторов на основе бензилиденкетона, которые имеют большие сечения двухфотонного поглощения (> 100 ГМ, 1 ГМ = 10−50 см4∙с/фотон). Использование P2CK позволило получить 2PP гидрогелевых каркасов из диакрилатов полиэтиленгликоля (PEGDA, Mw: 700 Да) с содержанием воды 50%. Хотя PEGDA обладают высокой реакционной способностью, раздражающее действие и токсичность акрилатных групп создают проблемы для применения в культивировании клеток. В другом труде ученые разработали производные виниловых эфиров желатина и гиалуроновой кислоты (HA от hyaluronan) для решения проблем токсичности PEGDA. Скорость цепной полимеризации виниловых эфиров умеренная, однако их сополимеризация с тиолами может значительно повысить фотореактивность до уровня акрилатов. По сравнению с дитирозиновым сшиванием, опосредованные радикалами тиол-еновые клик-реакции позволяют осуществлять более быстрое сшивание, поскольку один тиильный радикал может быть использован многократно в процессе сшивания.

Схема №1

Одним из ключевых моментов при изготовлении тиол-еновых гидрогелей является выбор водорастворимых тиолов, таких как дитиотреитол (DTT, N = 2, Mw: 154 Да) и дитиолы PEG (PEG2SH, N = 2, Mw: 2–5 кДа). Однако эти сшивающие агенты имеют ограниченное количество реактивных групп. DTT имеет тенденцию реагировать с той же полимерной цепью во время тиол-еновой сшивки, особенно при низких концентрациях полимера. Это приводит к образованию первичных петель, типа дефекта, вызванного внутримолекулярной сшивкой (схема 1a и 1b), что снижает связность сети и ухудшает стабильность геля. Эта проблема становится особенно актуальной при высокоточной микрофабрикации мягких г��дрогелей, подобных внеклеточному матриксу, с помощью 2PP, где низкая концентрация полимера является ключевым фактором для имитации низкой механической жесткости нативных тканей.

В рассматриваемом нами сегодня труде представлены разработка, синтез и функционализация макромолекулярного тиольного сшивающего агента на основе поливинилового спирта (PVASH) для быстрой микрофабрикации гидрогелей, взаимодействующих с клетками, методом двухфотонной полимеризации (2PP). Использование макромолекулярного тиольного сшивающего агента позволяет эффективно формировать стабильную структуру гидрогеля методом 2PP даже при низких концентрациях полимера, обеспечивая большую гибкость и свободу проектирования для высокоточной микрофабрикации гидрогелей (схема 1c).

Изображение №1

Ученые разработали двухэтапный процесс синтеза линкера PVASH с достаточным количеством тиольных групп и хорошей водорастворимостью (1a). Путем смешивания PVASH с PVA, функционализированным норборненом (nPVA), и фотоинициаторами был получен ряд высокоэффективных смесей. Затем были исследованы их физико-химические свойства в зависимости от концентрации полимера и архитектуры сшивающего агента. В отличие от широко используемых сшивающих агентов DTT и PEG2SH, созданный PVASH содержит множество реактивных групп (N > 10), что значительно повышает возможность печати в процессе 2PP. Кроме того, было показано, что напечатанные микрокаркасы могут быть биофункционализированы для применения в культивировании клеток и тканевой инженерии.

Результаты исследования

Разработка сшивающего агента PVASH

В данном исследовании были созданы PVASH, способные формировать эластично активные сетки при низких концентрациях полимера во время 2PP. Коммерческий чистый PVA содержит большое количество гидроксильных групп, от 200 до 2000, в зависимости от молекулярной массы. По сравнению с PEG, PVA является линейным полимером и предлагает большую гибкость в химических модификациях. Хотя PVA является биосовместимым полимером, его растворение в воде обычно требует нагревания из-за водородных связей. Один из элегантных подходов к улучшению его водорастворимости заключается в введении карбоксилатных групп натрия посредством реакции PVA с ангидридами. Например, были синтезированы наночастицы PVA с превосходной водорастворимо��тью. Биофункционализированные гидрогели наночастиц PVA использовались в качестве гемостатических материалов, гидрогелей, реагирующих на клетки, и для объемной биопечати.

Ранее сообщалось об одноэтапном методе синтеза PVASH путем превращения PVA с γ-тиобутиролактоном в сухом DMSO в течение 3 дней. Хотя степень замещения (DS от degree of substitution) достигала 6%, эффективность сшивания PVASH была ниже, чем у DTT, предположительно из-за плохой водорастворимости вследствие гидрофобности тиольных групп. Для решения этой проблемы был разработан двухэтапный подход. Сначала PVA модифицировали карбоксилатом натрия путем реакции с янтарным ангидридом. После диализа и нейтрализации был получен карбоксилат натрия PVA (PVA-COONa) с DS ~10%. Часть этих карбоксилатных групп затем использовали для прививки тиольных групп путем реакции с цистеамином. Важно отметить, что оставшиеся карбоксилатные группы натрия повышают водорастворимость макромера. По сравнению с ранее описанным методом, эти условия реакции более мягкие и обеспечивают больший контроль за счет регулирования молярного соотношения реагентов. Степень замещения как PVA-COONa, так и PVASH была подтверждена с помощью 1H-ЯМР. Смешивая nPVA и PVASH, была получена двойная смесь PVA, которая может быть фотосшита с помощью однофотонного или двухфотонного возбуждения с использованием либо LAP (фенил-2,4,6-триметилбензоилфосфинат лития, однофотонное возбуждение), либо P2CK (двухфотонное возбуждение) в качестве фотоинициатора (1b).

Было изучено тиол-еновое сшивание гидрогелей PVA (стехиометрическое соотношение тиолена 1:1) с использованием фотореологии in situ для оценки влияния различных тиоловых сшивающих агентов. В качестве эталонных образцов использовались два коммерческих дитиоловых сшивающих агента (DTT и PEG2SH) и один тетратиоловый сшивающий агент (PEG4SH, N = 4, Mw: 20 кДа).

Изображение №2

Модули упругости (G′) гидрогелей PVASH увеличивались с концентрацией макромера из-за более высокой концентрации реактивных групп, охватывая широкий диапазон от 0.1 до 10 кПа (2a). Группа PVASH показала наибольшее плато G′, превышающее значения эталонных групп при эквивалентных концентрациях прекурсора. В частности, плато G′ группы PVASH увеличилось с 0.16 кПа при концентрации полимера 1.5% до 7.8 кПа при 5%. Для сравнения, группа PEG2SH показала плато G′ 0.05 кПа при 2% и 3.9 кПа при 5%, в то время как группа DTT продемонстрировала плато G′ 0.018 кПа при 2%, увеличиваясь до 2.1 кПа при 5% (2b; таблица №1).

Таблица №1

Было проведено сравнение наклона G′ как показателя скорости сшивания. Группа PVASH показала значительно более высокий наклон G′ по сравнению с DTT и PEG2SH, особенно при концентрациях прекурсора ниже 3% (2c). Кроме того, для различных составов было оценено время начала гелеобразования (tonset), определяемое как первая точка времени, в которой G′ превышает 5 Па (2d). PVASH показал более низкие значения tonset, чем DTT и PEG2SH при концентрациях прекурсора 1.5%–3%. Это различие объясняется различными молекулярными архитектурами тиольных сшивающих агентов. Макромолекулярная структура PVASH обеспечивает более эффективное сшивание с nPVA и снижает вероятность образования первичной петли. В отличие от этого, DTT и PEG2SH демонстрируют зависимую от концентрации скорость сшивания и tonset. Эти результаты подчеркивают критическое влияние архитектуры сшивающего агента на тиол-еновое фотосшивание гидрогелей PVA. Интересно, что коммерческий тетратиольный сшивающий агент (PEG4SH) показал аналогичную эффективность, как и PVASH. Однако важно отметить, что PEG4SH содержит только четыре боковые тиольные группы, что может ограничивать его гибкость для функционализации RGD по сравнению с PVASH (около 26 тиольных групп).

Результаты фотореологических исследований были дополнительно подтверждены с помощью механических испытаний на неограниченное сжатие и анализа набухания различных гидрогелей (2e). Группа PVASH продемонстрировала значительно более высокие модули сжатия по сравнению с эталонными материалами. Примечательно, что группа DTT не может образовывать стабильные гидрогели, пригодные для испытаний на сжатие, при концентрации прекурсора ниже 3%, в то время как группе PEG2SH требуется минимальная концентрация 2%. Эти результаты подчеркивают преимущества PVASH в обеспечении эффективного фотосшивания и образования стабильных гидрогелей при низких концентрациях полимера.

Коэффициент набухания по массе (2f) использовался как индикатор дефектов в сетевой структуре. Коэффициент набухания уменьшается с увеличением концентрации полимера. При одинаковой концентрации группа PVASH показала самый низкий коэффициент набухания. Коэффициенты набухания групп DTT и PEG2SH при 3% составили 49.5 ± 8.44 и 29.0 ± 2.75 соответственно, в то время как группа PVASH показала значительно более низкий коэффициент набухания — 22.7 ± 4. Разница в объеме между гидрогелями PEG2SH и PVASH с концентрацией 2% показана на 2f (вверху).

Кроме того, для оценки конверсии тиолов был использован метод Эллмана путем количественного определения относительного количества тиольных групп до и после сшивания. PEG2SH и PVASH показали сопоставимую конверсию, превышающую 85% при концентрациях полимера 2% и 4%. В отличие от этого, DTT показал существенно более низкую конверсию при концентрации полимера 4% (∼76%). Эти результаты показывают, что PEG2SH и PVASH подвергаются эффективной и сопоставимой конверсии тиолов. При рассмотрении этих данных в совокупности с измерениями модуля сжатия и коэффициента набухания, они также указывают на наличие структурных дефектов в гидрогелевой сетке группы PEG2SH, особенно при низкой концентрации полимера (2%).

Изображение №3

Учитывая наличие сложноэфирных связей в предшественниках геля (схема выше), ученые оценили гидролитическую стабильность гидрогелей PVASH, инкубированных в PBS (pH 7.4 или 10) при 37 °C. Деградацию оценивали путем мониторинга изменений модуля сжатия и коэффициента набухания массы с течением времени. Модуль сжатия снижался в обоих условиях. При pH 10 модуль резко упал с ~14 до ~1.3 кПа в течение 12 дней (3b), тогда как при pH 7.4 он снизился более умеренно, с ~19 до ~14 кПа, с незначительными изменениями коэффициента набухания (3c). При pH 10 коэффициент набу��ания резко увеличился с ~19 на 1-й день до ~60 на 12-й день, что сопровождалось потерей точности формы (3d) и полной деградацией к 14-му дню, отражающей ускоренный гидролиз сложноэфирных групп внутри сетки. Эти результаты показывают, что деградация гидрогеля PVASH сильно зависит от pH: гели сохраняют структурную целостность в нейтральных условиях, но быстро деградируют в щелочных условиях.

Двухфотонная микрофабрикация

Изображение №4

Далее был изучен технологический диапазон PVASH для двухфотонной микрофабрикации гидрогелевых структур с использованием P2CK в качестве фотоинициатора. Диапазон оптимальных параметров обработки, позволяющих воспроизводимо изготавливать микроструктуры, определяется как «технологический диапазон». За пределами этого диапазона состав либо недостаточно отвержден, либо переотвержден. На 4a и 4b представлен сравнительный анализ технологического диапазона групп PEG2SH и PVASH (4%), где варьировались мощность лазера (10–100 мВт) и скорость сканирования (10–400 мм/с). Группа PVASH показала значительно больший технологический диапазон по сравнению с PEG2SH. Примечательно, что, несмотря на свою макромолекулярную природу, с коммерческим PEG4SH было получено лишь очень небольшое количество четко определенных структур. В отличие от этого, печать с DTT оказалась безуспешной при том же наборе параметров.

Для оценки механических свойств напечатанных микроструктур было проведено наноиндентирование на гидрогелях, содержащих 4% PVASH и 4% PEG2SH. Для прямого сравнения однофотонного УФ-сшивания и двухфотонной печати (2PP) были протестированы литые гели с одинаковыми составами в идентичных условиях на одном и том же приборе. Двухфотонная печать в значительной степени сохранила объемную жесткость 4% PVASH, в то время как 4% PEG2SH показал примерно на 50% меньшую жесткость, чем его литой контрольный образец. Эти результаты подчеркивают надежность PVASH для двухфотонной микрофабрикации и указывают на критическую роль молекулярной архитектуры сшивающего агента в определении механической фиксации при 2PP. По сравнению с тиолированной гиалуроновой кислотой (HASH) и тиолированным желатином (GelSH), которые по своей природе являются биоактивными и содержат клеточно-адгезивные мотивы, PVASH представляет собой полностью синтетическую альтернативу с большей гибкостью проектирования. В частности, фотоклик-гидрогели на основе PVA с тиол-норборненом позволяют практически независимо регулировать биохимическую функционализацию и механические свойства.

Видео №1

Примечательно, что при снижении концентрации полимера до 3% группа PVASH оставалась пригодной для печати в широком диапазоне параметров обработки, в то время как группа PEG2SH стала плохо пригодна для печати (видео №1). При снижении концентрации полимера до 2% пригодность для печати значительно снизилась из-за недостаточной плотности сшивания. Опираясь на концепцию двойной сети, ученые предположили, что включение жертвенной сети может улучшить пригодность для печати при низком содержании по��имера во время 2PP. Добавив 3% желатина, удалось улучшить пригодность для печати 2%-ной композиции PVASH в диапазоне параметров обработки, сопоставимом с диапазоном 4%-ной композиции PVASH. Напечатанные структуры оставались стабильными после двух дней инкубации при 37 °C. Более 80% желатина может диффундировать. Тем не менее необходимы дальнейшие исследования высвобождения желатина из гидрогелевых структур при 2PP.

Далее был использован объектив 40× для создания более тонких линий (0.2–1 мкм) с целью дальнейшей оценки возможности печати составов PVASH. Из-за ограничения размера пикселя конфокального микроскопа (приблизительно 0.23 мкм) элементы ниже этого порога не могли быть количественно оценены с высокой точностью. Поэтому измеренные ширины линий для элементов ≤ 0.6 мкм представляют собой верхние границы. Следовательно, видимая ширина самых тонких линий после набухания сузилась до ∼0.6–0.8 мкм, несмотря на исходную ширину 0.2–0.6 мкм (4c).

Видео №2

Кроме того, несколько 3D-структур произвольной формы (4d) были успешно напечатаны в течение 2–5 минут. Следует отметить, что форма Echinodermania (видео №2) использовалась в качестве эталона для демонстрации сложности и точности печатаемых элементов. По сравнению с ранее описанными тиол-еновыми составами на основе гиалуроновой кислоты (10–15%), исследуемый состав PVASH позволяет осуществлять 2PP-микроизготовление сложных гидрогелевых структур при более низких концентрациях полимера и более высоких скоростях сканирования.

Биосовместимость

Изображение №5

Предыдущие исследования подтвердили, что как nPVA, так и P2CK по существу нетоксичны. Как показано на 5a, биосовместимость растворов макромеров PVASH оценивали с помощью анализа пролиферации клеток MTS. Были выбраны фибробласты кожи человека (HDF от human dermal fibroblast), поскольку они широко используются в тканевой инженерии. Жизнеспособность клеток оставалась высокой (> 95%) после инкубации с клетками HDF в течение 24 часов (5b). Для изготовления микрокаркасов для культивирования клеток был выбран состав 4% PVASH. Состав гидрогеля был выбран с учетом возможности печати и точности формы, а не соответствия жесткости. Была изготовлена серия микрокаркасов с размерами (x-y-z: 300 × 300 × 50 мкм), но различными размерами пор (10, 25, 50 мкм). В состав были добавлены функционализированные nPVA конъюгаты аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD), способные к клик-реакции, для улучшения адгезии клеток. Контрольные эксперименты подтвердили, что клетки не прикреплялись к микрокаркасам без RGD, что подчеркивает необходимость нерастворимых мотивов RGD для прикрепления клеток к микропечатным гидрогелям.

Видео №3

Для визуализации организации цитоскелета было проведено окрашивание актиновых ядер. Клетки демонстрировали обширное распространение по микрокаркасам. В группе с размером пор 10 мкм клетки смогли эффективно расти и распространяться по всему пористому пространству (5c). Некоторые клетки даже формировали клеточные сети посредством длинных дендритных отростков. Примечательно, что некоторые клетки демонстрировали длинные отростки и локализованные межклеточные контакты в ответ на геометрию микрокаркаса (видео №3). Напротив, на микрокаркасах 25 мкм было обнаружено гораздо меньше клеток, предположительно потому, что размер пор слишком велик, чтобы предотвратить осаждение клеток. Для визуализации дочерних клеток после культивирования в течение 7 дней был использован анализ пролиферации клеток EdU. Средний процент EdU+ клеток на 7-й день оказался выше, чем на 4-й день (5d). Кроме того, иммунофлуоресцентное окрашивание на ассоциированный с YAP белок (YAP от Yes-associated protein) показало, что большая часть сигнала YAP локализована в цитоплазме (5e). Это указывает на то, что клетки воспринимают мягкую среду, обеспечиваемую микрокаркасами.

Клетки мезенхимальной стромы человека (hMSC от human mesenchymal stromal cell) культивировали на взаимодействующих с клетками конструкциях из 10 мкм микрокаркасов и трабекулярной кости бедра в течение до 14 дней в остеогенных условиях (5f, 5g). Помимо взаимодействия с микрокаркасами, наблюдалось также сокращение и кластеризация клеток, которые самоорганизовывались в плотную структуру вокруг каркасов. Это приводило к неоднородной плотности клеток по всему образцу, что может затруднить функциональную оценку. Тем не менее в некоторых микрокаркасах минерализация была обнаружена в порах с помощью окрашивания OsteoImage после двух недель остеогенной культуры. Хотя эти результаты предполагают, что hMSC минерализуют свой собственный внеклеточный матрикс внутри микрокаркасов и успешно дифференцируются в остеогенном направлении, переменная плотность клеток остается ограничением метода суспензионного посева. Включение поддерживающего 3D-матрикса может улучшить будущие культуры, способствуя однородному распределению клеток в течение всего периода культивирования. Эти результаты подтверждают пригодность гидрогелей PVASH для микроизготовления сложных клеточно-взаимодействующих гидрогелевых структур методом 2PP.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В рассмотренном нами сегодня труде ученые создали новый метод производства гидрогелевого композита, который может быть использован в качестве альтернативы имплантам, применяемым для заживления сложных переломов костей.

Переломы не являются редким видом травмы. Чаще всего процесс заживления протекает без необходимости в хирургическом вмешательстве. В более сложных случаях необходимо может понадобиться использование имплантов. Современные импланты обычно изготавливаются из собственной кости пациента, называемой аутотрансплантатом, или из металлических и керамических материалов. Аутотрансплантаты требуют дополнительной операции по сбору костной ткани, что увеличивает время восстановления и риски, связанные с операцией. Металлические импланты также могут создавать проблемы, поскольку они гораздо жестче, чем естественная кость, и со временем могут расшатываться, снижая долгосрочную стабильность.

Кость, как и любая другая часть организма, является сложной и сбалансированной структурой. Она содержит бесчисленные микроскопические туннели и полости, которые необходимы для прочности и функционирования.

Успешное восстановление кости зависит от того, насколько много типов клеток сначала перемещаются в имплант, а затем работают вместе, чтобы построить новую ткань. Когда кость ломается, организм не сразу создает твердую ткань. Вместо этого он формирует мягкую, проницаемую структуру. Этот временный каркас позволяет иммунным и регенеративным клеткам проникать внутрь, одновременно доставляя питательные вещества. Сеть фибрина удерживает эти клетки вместе. Со временем этот гибкий каркас медленно превращается в твердую кость.

Разработанный учеными гидрогель имитирует эту раннюю фазу заживления. Он состоит на 97% из воды и на 3% из биосовместимого полимера. Чтобы контролировать время и место затвердевания, ученые добавили две специализированные молекулы. Одна соединяет полимерные цепи, а другая реагирует при воздействии света, запуская процесс затвердевания. Связующая молекула позволяет быстро структурировать гидрогели в субмикрометровом диапазоне. Когда лазерные импульсы определенной длины волны попадают на материал, полимерные цепи немедленно соединяются и образуют твердую структуру. Участки, не подвергнутые возд��йствию лазера, остаются мягкими и могут быть удалены позже. Используя данную методику производства можно создавать структуры размером до 500 нанометров. Такие малые габариты крайне важны, ведь кости содержат огромное количество каналов, заполненных жидкостью. Как отмечают ученые, кусочек кости размером с игральную кость содержит порядка 74 км таких каналов, ширина которых может быть около 1 нанометра.

В ходе практических испытаний были созданы гидрогелевые структуры, смоделированные по образцу настоящий кости. С помощью точной визуализации удалось воссоздать тонкую решетку, известную как трабекулы, которая придает кости внутреннюю прочность. Опыты показали, что клетки, образующие костную ткань, быстро переместились в структурированный гидрогель и начали производить коллаген — ключевой строительный блок кости. Ученые также подтвердили, что материал биосовместим и не повреждает эти клетки.

В будущем ученые намерены усовершенствовать разработанную ими систему, которая должна позволить значительно упростить и обезопасить процесс заживления переломов.

Немного рекламы

Спасибо, что остаетесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 - 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB - от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?