Как стать автором
Обновить

О чем вы много думали, но боялись узнать #2 — мРНК вакцина, выработка иммунитета, S-белок

Время на прочтение11 мин
Количество просмотров26K
​ MIT News
​ MIT News

Дисклеймер:

  • как и прежде я постараюсь максимально точно раскрыть тему и ответить на интересующие вопросы;

  • в первую очередь я пишу о том, что мне наиболее инетересно и что я сам хочу глубже узнать, однако, если у вас есть интересные вопросы, то можете предлагать их мне для следующих частей;

  • прошу отнестись с пониманием, что я физически не могу отвечать на все вопросы в комментариях в малейших деталях;

  • я не привожу ссылок на источники (за исключением отдельных), так как все приведенные в моей статье сведения могут быть элементарно проверены;

  • в комментариях я также стараюсь не приводить ссылки, так как если человек интересуется, то найдет, а если он просто хочет докопаться, то его мои ссылки не устроят.

Начать я бы хотел с разъяснения некоторых основ биологии, которые помогут в понимании как мРНК вакцин, так и аденовирусных векторных вакцин, о которых я рассказывал раньше. Также меня резонно упрекнули в слишком сильном упрощении ДНК-РНК мира, и первой частью своего рассказа я исправляю данную неточность.

Центральная догма молекулярной биологии - ДНК, РНК, белки

Рисунок 1. Центральная догма молекулярной биологии
Рисунок 1. Центральная догма молекулярной биологии

В начале 1950-х Фрэнсис Крик сформулировал центральную догму молекулярной биологии, которая и по сей день остается актуальной, но с некоторыми оговорками. Мы не будем вдаваться в частные случаи, которые не соответствуют центральной догме, а перейдем к общему описанию умозаключений Ф. Крика. Итак, в основе всей жизни на земле лежит информационный поток от ДНК к РНК (транскрипция) и от РНК к белку (трансляция) (Рисунок 1a). Частным случаем является обратная транскрипция, при которой информация передается от РНК к ДНК. В эукариотах (к которым относятся животные и растения) обратная транскрипция наблюдается крайне редко и связана прежде всего с ретротранспозонами (генетическое наследие вирусов) и теломеразой (специальный фермент). Зато вирусы используют этот механизм для внедрения своего генетического кода в человеческую ДНК; но это относится никак не к аденовирусам, а к ретровирусам, самым известным представителем которых является ВИЧ. После трансляции белок еще не представлен в своей окончательной форме, а проходит ряд модификаций (одна из которых фолдинг), чтобы принять свою законченную форму. Также, белки часто представлены не отдельной структурой, а составляют целые комплексы со множеством взаимодействующих белков.

Рисунок 2. Разнообразие ДНК и РНК в человеческом организме
Рисунок 2. Разнообразие ДНК и РНК в человеческом организме

Так что же из себя представляют эти ДНК и РНК? В предыдущем посте я написал, что РНК представляет собой половину молекулы ДНК. Но на самом деле это не является определяющим отличием ДНК от РНК. Основное различие ДНК от РНК заключается в той основе, на которой они построены (Рисунок 1b): ДНК - дезоксирибоза, РНК - рибоза. В остальном они абсолютно подобны: обе имеют присоединенное азотистое основание и фосфатную группу. Общие азотистые основания ДНК и РНК - аденин (А), гуанин (G), цитозин (С); ДНК имеет тимин (Т), а РНК - урацил (U). По своей структуре ДНК в человеческих клетках представлен в основном в виде двух линейных антипараллельных цепочек, кодирующих наследуемую информацию в ядре (Рисунок 2). Также, в митохондриях (генерирует необходимую для клетки энергию) присутствует своя кольцевая двухцепочечная ДНК. Структура РНК в человеческом организме намного разнообразнее и представлена как линейной одноцепочечной молекулой в матричной РНК (мРНК) или при РНК интерференции (РНКи), так и различными по своему функционалу одноцепочечными РНК, которые могут составлять сложные трехмерные структуры (днк РНК - длинные некодирующие РНК, мнкРНК - малые некодирующие РНК, тРНК - транспортная РНК, рРНК - рибосомной РНК). Особую функцию несет мРНК - с нее как с шаблона делаются белки (тот самый S-белок тоже создается на мРНК). В то время как в клетках животных РНК ограничены одноцепочечным представлением, а ДНК ограничены двойной цепью, в вирусах присутствует полное разнообразие - ДНК и РНК в них представлены как в одноцепочечном представлении, так и в двухцепочечном.

мРНК вакцина

А теперь зная о том, как же все-таки появляются белки, давайте посмотрим свежим взглядом на аденовирусные векторные вакцины, где с ДНК вируса считывается сначала РНК, кодирующая шип белок, а потом по шаблону этой РНК создается множество копий S-белка.

Рисунок 3. Действие мРНК вакцины
Рисунок 3. Действие мРНК вакцины

В мРНК вакцинах информация течет иначе, чем в аденовирусных векторных вакцинах. Итак, мРНК вакцина представляет собой липидную (жировую) оболочку, содержащую внутри ту самую мРНК, кодирующую S-белок. При непосредственном контакте клетки и липидной оболочки, липидная оболочка оказывается поглощенной клеткой (Рискнок 3.1а). Липидная оболочка с мРНК вводится совместно с веществами, которые призваны усилить иммунный ответ - адъювантами (Рисунок 3.1b). В дальнейшем мРНК вакцина дрейфует внутри клетки (Рисунок 3.2) до тех пор пока в связи с изменением pH липидная оболочка не окажется разорванной (Рисунок 3.3). Высвободившаяся мРНК попадает в эндоплазматический ретикулум (Рисунок 3.4) (специально организованное пространство в клетке), где в рРНК (из предыдущей части) комплексах с нее происходит копирование протеина (Рисунок 3.5), который в дальнейшем будет свернут в рабочий S-белок (Рисунок 3.6). Доставки S-белка на поверхность клетки (Рисунок 3.8) обеспечивается с помощью аппарата Гольджи (Рисунок 3.7). На поверхности клетки иммунная система, заранее активированная адъювантами (Рисунок 3.1b), определяет его как чужеродный (Рисунок 3.9).

Казалось бы, что такого сложного сделать мРНК вакцину - берешь липидную оболочку и синтезированную мРНК S-белка? Проще же чем аденовирусная вакцина, или нет? Нет, не все так просто, когда нужно создать искуственную наноконструкцию с нуля. Существует ряд проблем, которые необходимо решить, чтобы создать мРНК вакцину:

  • Липидные наночастицы должны быть стабильны до того момента, пока не проникнут внутрь клетки.

  • Внутри клетки наоборот они должны эффективно освобождать мРНК.

  • Липидные наночастицы должны быть устойчивы как к окислительным агентам и действию ферментов (нуклеазы).

  • мРНК должны быть стабильны при длительном хранении

  • мРНК должны произвести большое количество S-белка, прежде чем быть уничтожены внутри клетки.

  • Произведенный S-белок должен эффективно взаимодействовать с иммунной системой, предоставляя иммуной системе для запоминания "правильные" эпитопы (об этом будет дальше).

При такой начальной сложности разработки у мРНК вакцин есть существенное преимущество перед аденовирусными векторными вакцинами - они достаточно просты в производстве. Также единожды разработанная технология по упаковке мРНК позволяет очень быстро разрабатывать последующие вакцины; достаточно просто "адаптировать" существующую мРНК под новый белок-антиген.

Выработка иммунитета

Рисунок 4. Выработка иммунного ответа
Рисунок 4. Выработка иммунного ответа

Что же происходит после того, как организм обнаруживает чужеродный белок, представленный на поверхности антиген-презентующей клетки (Рисунок 4.1а)? В ответ на чужеродные белок активизируются специализированные лимфоциты - Т-хелперы и Т-киллеры (Рисунки 4.2 и 4.4). Т-хелперы выпускают специальные сигнальные молекулы, которые активируют имунную систему и приводят организм в состояние готовности, а также помогают другим иммунным клеткам понять с каким инфекционным агентом они имеют дело. Т-киллеры при этом (Рисунок 4.7) определяют зараженные клетки и инициируют процесс контролируемой клеточной гибели; также они выпускают специальные молекулы, которые уничтожают вирусные частицы. Другой класс лимфоцитов, В-клетки, обеспечивают иной класс защиты от чужеродных частиц: при определении вирусного белка, они активизируются (Рисунок 4.1b) и через некоторое время могут трансформироваться в плазматическую клетку (Рисунок 4.8). При этом основная задача плазматической клетки - выработка специфических белков (антител) к конкретному патогену, которые блокируют функционирование патогена, а также помогают иммунной системе легче распознать недружественные элементы. Кроме всего прочего, Т-хелперы имеют способность усиливать и регулировать активность Т-киллеров и В-клеток (Рисунок 4.4). Т-хелперы обладают способностью становиться Т-хелперами памяти (Рисунок 4.3), которые долгое время могут помнить "сигнатуру" вируса и в любой момент могут перейти в активированную форму мобилизуя всю иммунную систему на войну с уже известным врагом. Т-киллеры и В-клетки также обладают способностью формировать клетки памяти (Рисунок 4.6) и хранить информацию о прошлых своих "мишенях". Т-хелперы в этом случае также помогают этим клеткам дольше сохранять знания о прошлых патогенах.

Так зачем же нужны две дозы вакцины, если клетки способны запоминать патогены? Особенность иммунной системы в том, что некоторые патогены наша иммунная система запоминает отлично, а вот другие плохо. Для того, чтобы усилить "иммунную память" и необходима вторая доза вакцины через определенный промежуток времени. При повторном попадании такого же или похожего патагена в организм (Рисунок 4.5) происходит активация уже существующих Т-хелперов памяти, Т-киллеров памяти и В-клеток памяти. При этом дополнительное усиление Т-хелперами памяти Т-киллеров и В-клеток. Таким образом, вызывается усиливающий каскад в иммунной системе, который мгновенно рекрутирует иммунную систему на противодействие (именно поэтому часто после второго укола наблюдается повышенная температура, головная боль и т.д.). При этом формируются более устойчивые клетки памяти.

S-белок

Рисунок 5. Структура S-белка
Рисунок 5. Структура S-белка

С глобальным механизмом работы иммунной системы мы разобрались. Но почему же ученые нацеливают иммунную систему на S-белок прежде всего? Почему нельзя взять за мишень какой-либо другой белок коронавируса? Для начала рассмотрим что же собой представляет S-белок. На Рисунке 5 приведена модель S-белка, который является достаточно крупным сам по себе - 180 kDa. Если вы были наблюдательными, то могли уже заметить, что сам S-белок представлен тремя мономерами (оранжевый, синий, зеленый), т.е. состоит из трех одинаковых белков. На виде сверху (левая часть) отлично видна симметрия тримера S-белка. И каждый мономер этого гигантского белка содержит в своем составе рецептор-связывающий домен (RBD-домен) и домен N-конца (NTD-домен).

Рисунок 6. Взаимодействие антитела и эпитопа S-белка
Рисунок 6. Взаимодействие антитела и эпитопа S-белка

Так вот коронавирус использует S-белок для связывания с рецептором клетки и проникновения внутрь; без него вирус просто не сможет проникнуть внутрь клетки. И одной из важнейших компонентой этого механизма является RBD-домен, который распознает АСЕ2 рецептор и инициирует процесс проникновения внутрь клетки. Если заблокировать данный домен антителами, которые вырабатывают упомянутые выше плазматические клетки, то вирус перестанет распространяться. Чтобы понять, как работает блокирование S-белка антителами давайте обратимся к Рисунку 6. На нем изображен тримерный S-белок и антитела, которые к нему прикрепились. Нейтрализующие антитела содежат два конца, которыми они могут прикрепляться к патогену и блокировать его. Участок, который находится на патогене и опознается антителами называется эпитоп; участки на концах антитела, которые опознают патоген называются паратопами. Если мы идем в микромир клеток и белков, то очевидные нам явления и обычная житейская логика перестают существовать. Этот мир подчиняется законам, где даже слабые водородные и электростатические силы начинают играть роль. Кстати, а хотите статью, в которой бы рассказывалось об особенностях существования микромира клетки?

Соединение эпитопа и паратопа, как и любых белков внутри клетки, обусловлено прежде всего слабыми взаимодействиями - электростатические, водородные, ван-дер-ваальса и гидрофобные связи. Это очень слабые связи и на них очень сильно влияет расстояние между двумя аминоксилотами (из них состоят протеины), а также само количество этих связей. Для того, чтобы антитело распознало эпитоп достаточно всего лишь 4-12 аминокислот. На Рисунке 6 внизу показано, что одни паратопы подходят к эпитопам, как детали конструктора (Рисунок 6, слева) и формируют более крепкие связи, а другие из-за их конфигурации не могут создать устойчивую пару (Рисунок 6, справа).

На Рисунке 5 справа изображен тот же самый тримерный S-белок, но с одной особенностью - один из RBD-доменов находится в активированом состоянии (M1'). Такая активация кроме того, что изменяет 3д структуру белка и прячет некоторые известные иммунной системе эпитопы, также усиливает возможность S-белка связываться с рецептором клетки. Такая активация S-белка просходит под воздействием протеаз (специальный фермент) не только в RBD-домене (S2'), но и между двумя структурным частями (S1/S2). Эти структурные изменения связывают в коронавирусе с его патогенностью.

Также как и RBD-домен должен быть достаточно специфичен к АСЕ2 рецептору, чтобы проникнуть внутрь клетки (а изменения в RBD-домене S-белка улучшают его возможность связываться с АСЕ2 рецептором), так и нейтрализующее антитело должно быть специфично к S-белку, а именно к RBD-домену. Размер всего S-белка составляет 1273 аминокислоты, RBD-домена - 222 аминокислоты и NTD-домена - 292 аминокислоты (размер распознаваемого эпитопа при этом 4-12 аминокислот). Таким образом на S-белке и его доменах может находиться множество эпитопов для антител, и иммунные клетки производят антитела сразу ко множеству эпитопов.

Я не зря упоминаю NTD-домен, так как нейтрализующие антитела к нему тоже блокируют возможность вируса проникать внутрь клеток. Однако, так как RBD-домен используется как своеобразный "ключ" и от его пространственной конфигурации зависит его возможность отпереть "замок" (АСЕ2 рецептор), то мутации, сильно изменяющие данный участок S-белка, приводят к потере возможности проникать внутрь клетки. С другой стороны, мутации NTD-домена не так сильно сказываются на способность коронавируса проникать внутрь клетки и следовательно этот домен мутирует намного сильнее, "пряча" S-белок от нейтрализующих антител. Таким образом, основной целью оказывается RBD-домен и мутации как раз в нем (Рисунок 5, правая нижняя картинка) связывают с возникновением наиболее сильных штаммов вируса: B117(Английский) ключевая мутация N501Y; B1351(Южноафриканский) - N501Y, E484K, K417N; P1(Бразильский) - N501Y, E484K; B1427-9(Калифорнийский) - L452R; B1671(Индийский) - E484K, L452R; B1.1.222(Мексиканский) - T478K.

В статье Effects of common mutations in the SARS-CoV-2 Spike RBD domain and its ligand the human ACE2 receptor on binding affinity and kinetics было определено, что мутации в RBD-домене N501Y и S477N повышают трансмиссивность вируса, мутации K417N/T в том же домене усиливают способность избегать иммуную систему, а мутация E484K приводит и к тому и к другому. В той же статье была оценена способность вируса заражать клетки. При оценке способности вируса заражать клетки оценивается возможность S-белка взаимодействовать с АСЕ2 рецептором, которая определяется константой диссоциации. Константа диссоциации (Kd) в биохимии это специфическая константа равновесия, которая определяет возможность крупного объекта разделиться (обратимо) на более мелкие объекты. Так вот, для немутировавшего RBD-домена Kd = 74.4 нМ (наномолей), для мутации N501Y Kd = 7.0 нМ, т.е. при такой мутации RBD-домен S-белка в 10.5 раз сильнее связывается с АСЕ2 рецептором. Для бразильского штамма (E484K/N501Y) эта константа составляет 5.1 нМ, т.е. в 14.5 раза сильнее. В то время как мутация K417N увеличивает константу диссоциации до 364 нМ.

Универсальная вакцина

​ Labiotech
​ Labiotech

Так все же, мы теперь будем вынуждены вечно колоть себе вакцину от возникающих новых штаммов, когда провалим вакцинацию всего населения Земли? У меня есть надежда, что нет. Еще в 2017 году ученые начали разработку универсальной вакцины от коронавирусов (да-да, не одного а многих), но из-за нехватики финансирования работы шли медленно. И вот глобальная пандемия помогла толкнуть эти разработки но новый уровень. На данный момент прорабатываются многие варианты для борьбы с коронавирусами.

Одной из многообещающих вакцин является вакцина, содержащая S-белки с разными RBD-доменами (как мы помним NTD-домены не подходят на эту роль из-за их мутационной изменчивости) к наиболее опасным/новым штаммам вируса, а также к другим представителям семейства коронавирусов (MERS-CoV и SARS-CoV-1). Полагаю, что развитие компьютерного моделирования взаимодействия между S-белком и АСЕ2 рецептором поможет предугадать и предсказать новые потенциально опасные мутации RBD-домена. И можно будет действовать на опережение. Опять же разные S-белки в вакцине смогут помочь выработать иммунитет к мутациям коронавируса. мРНК вакцины отлично подходят для такого применения из-за их сравнительно нетрудозатрадной перестройке под другую мРНК.

Другим разрабатываемым оружием против коронавируса может стать вакцина, состоящая из различных RBD-доменов, закрепленных на наночастице. Такая вакцина будет стимулировать клетки иммунитета распозновать только определенные RBD-домены.

Очень обещающей может быть вакцина с одним универсальным эпитопом или RBD-доменом, которая покроет целое семейство коронавирусов. Разработки в этой области идут и, возможно, через какое-то время свет увидит пан-коронавирусная вакцина, которая защитит не только от SARS-CoV-2, но и от MERS-CoV и SARS-CoV-1.

До сих пор не было создано никакого специфического лечения от коронавирусной инфекции, а все медицинские манипуляции сводились только к поддерживающей терапии. Однако, потенциальным лечением (хоть и дорогим пока что) является лечение нейтрализующими антителами. Да, такими же точно антителами, которые производят наши плазматические клетки. Все отличие заключается в том, что можно заранее создать достаточный объем нейтрализующих антител (которые спроектированы для блокирования S-белка коронавируса) и доставить их в организм для борьбы с коронавирусом, а не ждать пока иммунная система распознает патоген и начнет производить собственные. На данный момент было показано, что применение нейтрализующих антител на ранних стадиях развития заболевания приводит к более легкому течению болезни, в то время как применение антител на поздних стадиях заболевания не принесло сколь бы то ни было статистически значимого улучшения. Нейтрализующие антитела также можно спроектировать для определения заранее заданного RBD-домена.

Это продолжение моего рассказа, в котором я вас знакомлю с вакцинами против коронавируса и их механизмами действия. В ней я погружаюсь глубже в недра молекулярной биологии, чтобы познакомить вас с центральной догмой, а также со структурой S-белка и его взаимодействием с антителами. Ну и напоследок мы немного пофантазируем на тему создания универсальной вакцины.

Только зарегистрированные пользователи могут участвовать в опросе. Войдите, пожалуйста.
Хотите статью, в которой бы рассказывалось об особенностях существования микромира клетки?
95.6% Да152
4.4% Нет7
Проголосовали 159 пользователей. Воздержались 25 пользователей.
Теги:
Хабы:
Всего голосов 20: ↑19 и ↓1+29
Комментарии163

Публикации

Истории

Ближайшие события

19 сентября
CDI Conf 2024
Москва
24 сентября
Конференция Fin.Bot 2024
МоскваОнлайн