Что может вызывать отвращение у человека? Кому-то противно смотреть на змей, кто-то шарахается от пауков, а для некоторых черви являются самыми мерзкими существами во Вселенной. Но, несмотря на брезгливость некоторых людей, любые живые существа несут не только вред, но и пользу. Дождевые черви, как известно, крайне полезные существа в сельском хозяйстве, а пиявки издревле использовались в медицине. И те, и другие относятся к кольчатым червям. А вот репутация круглых червей (нематод) куда более неоднозначна, учитывая большое число паразитических видов. И вот ученые из университета Осаки (Япония) решили помочь нематодам, предпочитающим жить в организме человека, реабилитироваться и встать на сторону добра. Для этого ученые создали специальные «костюмы», одев которые на нематоду, ее можно наделить рядом полезных свойств. Из чего сделан костюм нематоды, какими именно свойствами он ее наделяет, и как нарядная нематода может помочь современной медицине? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых. Поехали.
Основа исследования
Что есть кожа? В определенном смысле это природный биологический костюм, который служит барьером, защищающим организм от воздействия окружающей среды. К тому же внешняя оболочка организма является точкой контакта между сигнальными и рецепторными белками, которые влияют на поведение и даже на выживание.
Недавние достижения в технологии инкапсуляции позволили модифицировать клеточные поверхности с помощью различных материалов: клетки млекопитающих модифицировали гидрогелями, клетки дрожжей железными нанооболочками, а Chlorella и Daphnia magna оболочками из оксида титана. Эти поверхностные модификации позволили ввести новые функции, а также усилили исходные функции клетки.
Большую долю внимания в такого рода исследованиях получают одноклеточные организмы либо отдельные клетки многоклеточных, но еще не было опытов, где бы ученые попытались изменить или модифицировать оболочку многоклеточного организма целиком.
Многоклеточные организмы, такие как нематоды, более тесно связаны с человеком и имеют сложную анатомию и физиологические функции. Они также живут в более разнообразной среде по сравнению с одноклеточными организмами. Таким образом, функционализация нематод может оказать влияние на биомедицинские, экологические и промышленные области. В свете этого был разработан метод модификации поверхности для функционализации нематоды путем загрузки материалов на ее поверхность.
Модификация поверхности нематоды уже осуществлялась ранее, однако для этого требовалось использовать катионные полимеры. Положительно заряженные полимеры часто проявляют токсичность из-за их взаимодействия с клеточными мембранами. Более того, прямой контакт между отрицательно заряженной мембраной и положительно заряженными молекулами также может активировать случайные пути эндоцитоза для прохождения этих материалов через мембрану.
Изображение №1
В рассматриваемом нами сегодня труде ученые продемонстрировали первую в мире функционализацию поверхности нематод различными гидрогелями с разными свойствами. Они разработали метод перекрестного связывания in situ на кутикуле нематод (CTICLE от cross-linking technique on a nematode cuticle) для функционализации поверхности путем изготовления гидрогелевой оболочки из биосовместимых полимеров (схема выше).
Для опытов было выбрано два вида нематод — C. Elegans и Anisakis simplex (A. Simplex). C. Elegans является почвенным червем и был первым многоклеточным организмом, геном которого был секвенирован, при этом 65% его генов имеют гомологи с генами, связанными с заболеваниями человека. Эти гомологичные гены делают C. Elegans подходящей моделью для биомедицинских исследований, включая скрининг токсичности, разработку лекарств и скрининг лекарств от рака. В свою очередь A. Simplex обладает потенциальной способностью химически определять рак и прикрепляться к раковым тканям.
Результаты исследования
Чтобы изготовить стабильную гидрогелевую оболочку, пероксидазу хрена (HRP от horseradish peroxidase) конъюгировали с производным олеиловой цепи, связанным с полиэтиленгликолем, известным как биосовместимый якорь для мембраны (BAM от biocompatible anchor for membrane). HRP, конъюгированный с BAM (BAM-HRP), позволяет иммобилизовать HRP на кутикуле нематоды.
Ученые отмечают, что опосредованное HRP сшивание полимеров, содержащих фенольные группы (Polymer-Ph), в присутствии H2O2 является эффективным методом для различных целей, таких как инкапсуляция клеток, 3D-биопечать и заживление ран in situ.
Изображение №2
Чтобы продемонстрировать возможности CTICLE, ученые покрыли поверхности C. Elegans и A. Simplex гидрогелевыми оболочками, состоящими из Ph-модифицированного альгината (Alginate-Ph), желатина (Gelatin-Ph) и поли(винилового спирта) (PVA-Ph). Также была выполнена оценка влияния данного покрытия на жизнеспособность, хемотаксис* и передвижение нематод.
Хемотаксис* — двигательная реакция микроорганизмов на химический раздражитель.Функционализацию поверхностей нематод исследовали путем оценки функций отдельных гидрогелевых оболочек в качестве защитного экрана от УФ-излучения и H2O2, а также в качестве «копья», позволяющего нематоде быть потенциальным живым лекарством от рака.
Чтобы определить влияние образования гидрогелевой оболочки in situ на поверхности нематод, состав растворов и степень покрытия были исследованы на C. Elegans. Гидрогелевую оболочку наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием флуоресцентно-меченого полимера-Ph на поверхности нематоды.
Первым делом была исследована возможность изготовления гидрогелевой оболочки на поверхности C. Elegans с использованием нативной HRP, чтобы определить необходимость конъюгации BAM с HRP для иммобилизации фермента на поверхности нематод.
C. Elegans, погруженные в раствор, содержащий от 5 до 190 ед/мл (единиц на миллилитр) HRP, с последующим погружением в раствор, содержащий 1.0% масс./об. альгинат-Ph, меченный аминофлуоресцеином (Alg-Ph-AF) и 0.1 мМ H2O2, не показали флуоресценции, приписываемой Alg-Ph-AF. Гидрогелевая оболочка Alg-Ph-AF также не формировалась на поверхности C. Elegans, погруженной в раствор, содержащий только Alg-Ph-AF и H2O2 (2а).
А вот C. Elegans, последовательно погруженные в раствор, содержащий 12 мкг/мл BAM-HRP, и раствор, содержащий 1.0 % масс./об. Alg-Ph-AF и 0.1 мМ H2O2, показали флуоресценцию, приписываемую Alg-Ph-AF оболочке (2b).
Наблюдение с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа показало, что гидрогелевая оболочка была локализована на поверхности нематоды (2b). Толщина гидрогелевой оболочки Alg-Ph-AF составляла 8.0 ± 0.4 мкм. Это значение больше, чем сообщаемое для клеточного покрытия, изготовленного с использованием перекрестного связывания, опосредованного HRP (от 250 нм до 1 мкм). Такое различие может быть связано с более высокой поверхностной плотностью молекул BAM-HRP, введенных на поверхность нематод, по сравнению с клетками. Кроме того, кутикула нематод отличается от клеточной поверхности: кутикула нематод состоит из многочисленных кольцеобразных структур, называемых кольцом (annulus). Клеточная мембрана имеет ровную поверхность толщиной 3 нм, тогда как неровная поверхность нематод обладает перепадами глубины примерно в 40-100 нм. Эта неровная поверхность приводит к закреплению BAM-HRP под разными углами и положениями, что, в свою очередь, приводит к образованию более толстого гидрогелевого слоя по сравнению с клеточной мембраной.
Важно и то, что вышеописанные результаты не были уникальными только для Alg-Ph-AF, поскольку гидрогелевые оболочки были также получены из Gelatin-Ph, меченного родамином (Gela-Ph-Rho) (2c), и поли(винилового спирта)-Ph, меченного 5-(2-аминоэтиламино)-1-нафталинсульфокислота (PVA-Ph- EDANS) (2d).
Эти результаты демонстрируют необходимость иммобилизации HRP на поверхности нематод с помощью BAM-HRP перед погружением в раствор, содержащим Polymer-Ph и H2O2, а также возможность получения гидрогелевых оболочек с различными функциями из различных материалов, сшиваемых с помощью HRP-опосредованных реакций.
Чтобы дополнительно продемонстрировать универсальность этого метода, гидрогелевую оболочку изготовили на поверхности другого вида нематод, а именно на A. Simplex. A. Simplex — это морская нематода, которая паразитирует в разных рыбах и даже в людях.
В предыдущем исследовании сообщалось, что кутикула A. Simplex состоит из липидов, причем наиболее распространенной фракцией являются жирные кислоты. Этот липидный слой позволяет закреплять BAM-HRP, что, в свою очередь, позволяет формировать гидрогелевую оболочку на поверхности нематоды.
Подобно результатам, полученным для C. Elegans, гидрогелевая оболочка не образовывалась на A. Simplex, погруженном в раствор, содержащий только полимер-Ph и H2O2 (2e), но формировалась при последовательном погружении в раствор, содержащий BAM-HRP и раствор, содержащий Alg-Ph-AF или Gela-Ph-Rho и H2O2 (2f, 2g). Также была изготовлена двухслойная гидрогелевая оболочка из двух материалов путем последовательного погружения нематод в растворы, содержащие Alg-Ph-AF и Gela-Ph-Rho (2h).
Конфокальная микроскопия A. Simplex, покрытого гидрогелевыми оболочками Alg-Ph-AF и Gela-Ph-Rho (2i), выявила подробную структуру кутикулы, включая кольцо и борозду, демонстрируя возможность использования двухслойного гидрогелевого покрытие для изучения кутикулы.
Изображение №3
Затем было исследовано влияние образования гидрогелевой оболочки in situ посредством гидрогелирования, опосредованного HRP, на жизнеспособность и физиологические функции (хемотаксис и передвижение) нематод.
В то время как H2O2 может обладать токсическим эффектом, ее концентрация, используемая в данном исследовании (0.1 мМ), показала минимальный токсический эффект на C. Elegans с >90% жизнеспособностью после 10 минут инкубации и 80% жизнеспособностью через 60 минут. C. Elegans также показал высокую жизнеспособность (> 90%) до и сразу после покрытия BAM-HRP, а также через 1-72 часа после покрытия (3а). Аналогичная картина наблюдалась и у A. Simplex (3b), что свидетельствует о незначительном влиянии метода CTICLE на жизнеспособность нематод.
Далее было исследовано влияние гидрогелевого покрытия на хемотаксис нематод.
C. Elegans дикого типа (необработанный) сильно притягивается к 1.0% об./об. изоамилового спирта (IAA) в этаноле и демонстрирует движение в ответ на раздражитель. C. Elegans, покрытый гидрогелевой оболочкой Alg-Ph-AF, демонстрировал реакцию притяжения на IAA. Не было обнаружено существенной разницы в коэффициенте хемотаксиса (определяемом, как показано на 3c) между значениями, обнаруженными у C. Elegans с гидрогелевой оболочкой и без нее (3d; р > 0.05).
Этот результат указывает на то, что диффузия низкомолекулярных соединений, таких как IAA, не предотвращается в сети гидрогеля, что позволяет обнаруживать IAA сенсорными нейронами C. Elegans.
Кроме того, гидрогелевая оболочка не замедляла скорость передвижения C. Elegans (3e и видео №1). Флуоресцентное наблюдение за C. Elegans, покрытым гидрогелем, показало, что гидрогелевая оболочка оставалась на поверхности кутикулы, несмотря на движение по пластине с агаром (3f и видео №2).
Видео №1
Видео №2
Дальнейшее наблюдение показало, что гидрогелевая оболочка оставалась на поверхности C. Elegans в течение 3 дней после нанесения. Вероятно, стабильное присутствие гидрогелевой оболочки на поверхности нематоды обусловлено толщиной гидрогеля.
В совокупности эти результаты показывают, что метод CTICLE безвреден для нематод с минимальным воздействием на жизнеспособность и физиологические функции. Этот вывод согласуется с предыдущими исследованиями, в которых сообщалось о биосовместимости метода инкапсуляции клеток, опосредованного HRP, с использованием как гомогенно растворенного HRP, так и закрепленного HRP.
Изображение №4
Как упоминалось выше, метод CTICLE позволяет создавать гидрогелевые оболочки из различных материалов на поверхности нематод с минимальным влиянием на жизнеспособность, хемотаксис и передвижение. Это означает, что метод CTICLE может сделать нематоды еще более полезными, придавая функции гидрогелевой оболочке путем включения функциональных молекул.
В качестве проверки данной теории ученые изучили гидрогелевые оболочки, которые защищают нематод от воздействия УФ-излучения и перекиси водорода.
Гидрогелевая оболочка отлично препятствует пропусканию УФ-света (4а). По сравнению с пропусканием УФ-света через раствор альгината натрия предотвращение пропускания гидрогелем Alg-Ph-AF можно объяснить наличием несшитых или сшитых групп Ph (4b).
Анализ жизнеспособности показал дозозависимую токсичность у C. Elegans без покрытия, подвергшихся воздействию 1000 Дж/м2 UV-C (254 нм; 0-1000 Дж/м2) (4c). Напротив, C. Elegans, покрытые гидрогелевой оболочкой Alg-Ph-AF, имели более высокую жизнеспособность до 60% при самой высокой дозе облучения в 1000 Дж/м2. Эти результаты продемонстрировали, что гидрогель Alg-Ph-AF защищает C. Elegans от вредного ультрафиолетового излучения.
Значительное количество H2O2 попадает в почву как влажным, так и сухим атмосферным осаждением. H2O2 широко используется для удаления органических веществ при ремедиации почвы, а обработка с помощью H2O2 вредна для биологических организмов, живущих в почве, включая C. Elegans. Известно, что каталаза оказывает защитное действие против перекиси водорода, расщепляя ее на кислород и воду.
По этой причине ученые добавили производное каталазы, содержащее фенольные фрагменты (Catalase-Ph), в гидрогелевую оболочку Alg-Ph-AF посредством HRP-опосредованной конъюгации этих двух молекул (4d).
Как и ожидалось, полученная оболочка из гидрогеля функционировала как щит для защиты C. Elegans от H2O2, показывая более высокую жизнеспособность, чем у C. Elegans без покрытия (4e). Образование пузырьков также наблюдалось у C. Elegans, содержащих H2O2 и покрытых гидрогелевой оболочкой, содержащей Catalase-Ph, что указывает на разложение H2O2 на кислород и воду.
Изображение №5
Если же гидрогелевая оболочка должна служить не как щит, а как копье (т. е. как средство борьбы, а не защиты), то для этого существует множество молекул, которые могут это реализовать. В данном труде ученые решили остановиться на глюкозооксидазе (GOX).
Хотя есть несколько проблем, которые необходимо преодолеть, такие как аллергические реакции на антигены паразита и удаление по требованию после достижения цели, в качестве доказательства теории ученые изучили потенциальную способность нематоды быть живой системой доставки лекарств для лечения рака (5а).
Во многих клинических исследованиях сообщалось о присутствии Anisakis при раке желудочно-кишечного тракта человека, а недавнее исследование показало, что Anisakis может химически ощущать рак и прикрепляться к раковой ткани из-за изменений в муцине вокруг рака.
GOX катализирует превращение D-глюкозы в D-глюконовую кислоту и перекись водорода (H2O2). Истощение запасов глюкозы как источника энергии раковых клеток может привести к гибели раковых клеток, в то время как образующийся H2O2 может убивать раковые клетки как окислитель. Окисление глюкозы GOX также влияет на среду опухоли в виде усиленной гипоксии из-за потребления O2 и повышенной кислотности за счет продукции D-глюконовой кислоты.
Ученые изучили эффективность гидрогелевой оболочки, содержащей GOX, в уничтожении клеток HeLa после проверки дозозависимой индукции их гибели за счет действия GOX посредством апоптоза.
Чтобы исключить отслоение клеток, вызванное прямым контактом с движущимся A. Simplex, клетки HeLa, прилипшие к чашам для культивирования клеток, были покрыты гидрогелем из метакрилового желатина (GelMA) толщиной 2 мм (5b).
Перед опытами с использованием клеток HeLa ученые исследовали профиль продукции H2O2 GOX, содержащимся в гидрогелевой оболочке, путем помещения NAGOX в раствор, содержащий 1 мг/мл D-глюкозы. Содержание H2O2 в растворе увеличивалось с увеличением времени инкубации в течение первых 10 часов, а затем достигало постоянного значения в 2 мМ в присутствии NAGOX (5c). В случае использования A. Simplex без покрытия продукция H2O2 никак не менялась.
Концентрация H2O2, продуцируемого NAGOX, выше, чем те, которые вызывают гибель или повреждение клеток в клеточной линии HeLa, рака легкого и аденокарциномы желудка.
Флуоресцентное наблюдение за клетками, окрашенными йодидом пропидия (PI) (5d), показало, что клетки HeLa, совместно культивированные с NAGOX в течение 24 часов, показали в 36 раз больше клеток, окрашенных PI, по сравнению с контрольной группой (5e). Эти результаты показали, что NAGOX индуцирует апоптоз (клеточную смерть) в клетках HeLa.
В совокупности покрытие нематод гидрогелевой оболочкой, нагруженной GOX, может стать многообещающим методом разработки живой системы доставки лекарств для лечения рака с высокой эффективностью.
Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых.
Эпилог
В рассмотренном нами сегодня труде ученые решили буквально изменить жизнь нематод, наделив их новыми функциями. Это стало возможным благодаря покрытию нематод специальным гидрогелевым слоем, содержащим те или иные функциональные молекулы.
Приодетые нематоды получили именно те свойства, которые ученые и планировали. К примеру, они стали менее восприимчивы к ультрафиолету и H2O2. Но куда более важной особенностью функционального костюма для нематод является возможность использовать их для борьбы с раковыми клетками.
Суть в том, что нематоды вида A. Simplex, которые участвовали в опытах, обожают раковые клетки. Если таковые имеются в организме носителя, то нематоды их ощущают на химическом уровне и спешат найти. Ученые наделили нематод способностью убивать раковые клетки, которые они совершенно самостоятельно и вполне успешно находят.
По мнению ученых, такой метод доставки лекарств может быть эффективен не только в случае рака, но и других заболеваний, вызванных теми или иными патогенами. В будущем они намерены продолжить исследование, дабы узнать, какими еще полезными функциями можно наделить нематод.
Немного рекламы
Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).
Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?
