Одним из важнейших и самых узнаваемых изображений в истории науки XX века является двойная спираль ДНК. Старина Джеймс Уотсон, в конце жизни сильно сдавший, а до этого постепенно вытесненный и низложенный из рядов неолиберального научного сообщества за острую и непримиримую гражданскую позицию, имеет все шансы отметить в начале апреля свой 97-й день рождения. Он пережил своего прославленного коллегу Френсиса Крика более чем на 20 лет и не только стал первым человеком, чей геном был полностью секвенирован (это произошло в 2007 году), но и в полной мере застал новую эпоху, в которую нуклеотидные цепочки не только редактируются, но и конструируются с нуля. Ниже я расскажу о некоторых опытах по расширению генетического алфавита ДНК и о создании нуклеиновых кислот с расширенным набором нуклеотидов. Такие исследования восходят к середине 1980-х, когда ими независимо занялись биолог Стивен Беннер, биохимик Эрик Кул, биохимик Флойд Ромсберг, а также некоторые другие учёные. Для контекста приведу взятую отсюда инфографику, которая иллюстрирует хронологию описываемых исследований.
В основе эволюции лежит принцип «выживает наиболее приспособленный», и самый базовый уровень живой материи, на котором сохраняется этот принцип – это устройство нуклеиновых кислот. Молекула ДНК обладает достаточной прочностью, чтобы сохранять целостность и при этом служить шаблоном для сборки белков. Четыре азотистых основания (нуклеотиды) формируют двойную спираль по принципу комплементарности (взаимного встраивания). Поэтому молекулы ДНК могут иметь разную длину в зависимости от того, какому организму принадлежат, но всё равно работают по одинаковому принципу и служат для формирования принципиально схожих белков. Четыре нуклеотида, входящих в состав ДНК — аденин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц) и тимин (Т). Благодаря комплементарности, Ц в норме соединяется с Г, а А – с Т. Поэтому одна спираль ДНК служит шаблоном для другой, и на основе одной цепочки ДНК всегда можно достроить другую. Эти процессы находятся на стыке информатики и биологии, информационное осмысление алфавита ДНК – фундаментальная тема, не раз поднимавшаяся на Хабре. Одна из самых фундаментальных статей, описывающих реализацию трёхмерного ДНК-подобного движка в коде, вышла в конце 2020 года, принадлежит уважаемому Ярославу Сергиенко @pallada92. Тем не менее, комплементарность присуща не только естественным азотистым основаниям.
Эта демонстрационная модель напоминает, почему молекула ДНК обычно имеет форму двойной спирали. Нуклеотиды, входящие в её состав, соединяются строго со своими парными нуклеотидами: гуанин с цитозином и тимин с аденином. Подставить на место этих нуклеотидов другие компоненты практически невозможно (если мы подразумеваем дальнейшее нормальное копирование и репликацию расширенной ДНК), однако их можно вставлять попарно. В таком случае, если уподобить молекулу ДНК лестнице, в ней появятся новые «ступеньки», и теоретически это позволит обогатить передаваемый генетический материал с сохранением структуры двойной спирали, а также с сохранением комплементарности естественных нуклеотидов.
Стивен Беннер впервые получил искусственные нуклеотиды во второй половине 1980-х, а Флойд Ромсберг в 2014 году смог внедрить парные искусственные основания в живую клетку. Эти исследования, а также сопутствующий вклад Эрика Кула, заслуживают более подробного рассмотрения, и я о них расскажу ниже.
Кубок конструкторов
В 1986 году Беннер возглавил биохимическую лабораторию в Высшей технологической школе Цюриха (ETHZ) и взялся перестраивать каркас ДНК, состоящий из двух спиралей. В состав этого каркаса входят фосфаты, имеющие отрицательный заряд, а также сахара. Таким образом, участки каркаса взаимно отталкиваются, и это позволяет сохранять между ними просвет, внутри которого протянута лесенка нуклеотидов. Беннер пытался заменять отрицательные группы на нейтральные, но такая цепочка сохраняла стабильность лишь на очень небольших отрезках. Как только в ней накапливалось около 10 пар оснований, она свёртывалась в кольцо. Таким образом, для искусственного наращивания ДНК новыми основаниями или искусственного создания подобных молекул требуется:
Добавлять основания попарно, чтобы они были комплементарны друг другу, а не вступали в пару с естественными основаниями.
Обеспечить достаточную гидрофобность каркаса молекулы, чтобы между двумя спиралями сохранялся просвет, но при этом и достаточную гидрофильность самих оснований, чтобы между ними могли возникать связи водород-водород, а РНК могла надёжно копировать информацию, также через гидрофильное взаимодействие.
На первом этапе работы (в конце 1980-х) группа Беннера синтезировала первую пару искусственных нуклеотидов: изогуанин и изоцитозин — являющихся, соответственно, изомерами (топологическими вариантами) гуанина и цитозина и комплементарных друг другу.
Оказалось, что ферменты-полимеразы, копирующие ДНК и транскрибирующие её в РНК, исправно читают двойную спираль, содержащую искусственные основания и добавляют такую комплементарную пару в наращиваемую нить нуклеиновой кислоты. В свою очередь, рибосомы — клеточные органеллы, отвечающие за трансляцию РНК в белок — считывают изоцитозин и добавляют в растущий белок синтетическую аминокислоту. Но в этой паре мы работаем с изомерами, а это оказалось сопряжено с дополнительными рисками: в растворе крайний водород в изогуанине может спонтанно менять положение, и из-за этого изогуанин становится комплементарен не изоцитозину, а тимину, вступает с ним в связь. ДНК становится нерабочей.
Вскоре после Беннера аналогичными исследованиями занялся биохимик Эрик Кул из Стэнфордского университета. Он приступил к разработке дизайнерской ДНК в середине 1990-х. Кула интересовало не столько сходство искусственных нуклеотидов с естественными, сколько стабильность водородных связей. Первым большим успехом Кула был синтез основания F – дифтортолуола. Этот нуклеотид был практически идентичен по форме тимину, но на месте атомов кислорода в нём стояли атомы фтора. В такой конфигурации атомы водорода прочно оставались на своих местах и не образовывали непредусмотренных связей.
Практика показала, что сам фтор в такой конфигурации очень плохо связывается с водородом, но полимеразы всё равно обращаются с незнакомым нуклеотидом как с тимином: ставят его в пару с аденином, либо, наоборот, прикрепляют к нему аденин. Кул заключил, что в формировании пар важна не только химическая, но и геометрическая составляющая. Основания соединяются по принципу «ключ-замок».
Впоследствии группа Беннера провела серию экспериментов, показавших, что молекула ДНК с искусственными основаниями сохраняет не только форму, но и информационную функцию. Нуклеотиды связываются в предсказуемом порядке, нормально поддаются репликации, умеренно мутируют. Важнее всего, что синтетическая ДНК нормально транскрибируется в РНК. Для демонстрации этой способности Беннер с коллегами синтезировали участок синтетической ДНК, которая кодирует аптамер. Аптамер — это последовательность, которая не служит шаблоном-трафаретом для белка, а связывается с конкретными молекулами и активирует их, заставляя проявлять характерные свойства. Аптамер Беннера активировал флуоресцентную молекулу, и его срабатывание в растворе сразу было заметно:
Далее с течение 2010-х годов Беннер с коллегами разрабатывали новые пары нуклеотидов, которые более или менее удачно встраивались в ДНК. Однако есть причины полагать, что ДНК может включать и 10, и 12 оснований («букв»). В феврале 2019 года Беннер получил ныне уже знаменитую хатимодзи-ДНК. «Хатимодзи» в переводе с японского означает «восемь букв». Наряду с естественными А, G, C и Т в хатимодзи-ДНК входят изогуанин (B), изоцитозин (rS) а также ещё одна пара, которую Беннер обозначил «dS» (1-метилцитозин)
и «Z» (6-амино-5-нитропиридин-2-ol).
Вот как выглядит хатимодзи-ДНК в 3D
Чуть позже Эрика Кула к исследованию искусственных нуклеотидов подключился Флойд Ромсберг, который интересовался в первую очередь расширением набора гидрофобных оснований. За основу он взял простейшие органические соединения, содержащие двойные связи — бензол и нафталин. Далее, по словам Ромсберга, они с коллегами принялись синтезировать «любые мыслимые производные», многие из которых на первый взгляд вообще не походили на основания ДНК. Именно в процессе этого поиска Ромсберг заметил, что в потенциальных основаниях для ДНК должны деликатно сочетаться гидрофильность и гидрофобность, о чём я писал выше. Основание должно быть достаточно гидрофобным, чтобы ферменты могли вставить его в ДНК, но при этом и умеренно гидрофильным, чтобы принимать водородные связи. Последний аспект необходим для успешного копирования информации.
В течение 2000-х Ромсберг успел проверить около 3600 соединений и выбрать из них десятки кандидатов на роль нуклеотидов. Эти исследования вписались в более широкий контекст конструирования лекарств. Дополнительно опираясь на знания о взаимосвязях «структура-активность», Ромсберг разработал набор новых оснований, стараясь как можно сильнее сократить их гидрофобную поверхность. В числе таких пар он отдельно упоминает dTPT3–dNaM, которая ничуть не уступает естественным нуклеотидам в скорости и точности репликации.
В настоящее время конструирование искусственных оснований для ДНК постепенно переходит из качества в количество, а различные исследовательские группы (в первую очередь, Ромсберг) добиваются первых положительных результатов по выживаемости биологических клеток, в которые внедрена частично искусственная ДНК. Стивен Беннер руководит Фондом прикладной молекулярной эволюции во Флориде, Эрик Кул продолжает исследования по синтезу чужеродных нуклеиновых кислот (XNA) в Стэнфорде, Флойд Ромсберг сосредоточен на разработке таких нуклеотидов, репликация которых была бы применима не только в генетических целях, но и для ускоренного размножения ДНК (амплификации) и превращения этой молекулы в органическое хранилище данных. Наряду с ними синтезом новых нуклеотидов занимается группа под руководством Ичиро Хирао из японского центра RIKEN по системной и структурной биологии. Таким образом, возможность расширения генетического алфавита многократно независимо доказана. Остаётся поговорить о том, каковы могут быть обозримые последствия таких вмешательств. Для начала давайте обсудим, почему ДНК лишь по форме является кислотой, а по сути — информационной молекулой.
Информационная молекула
Основное назначение нуклеиновых кислот — это хранение информации. Последовательности букв-нуклеотидов складываются в чертежи для конструирования белков. Естественный набор из четырёх нуклеотидов кодирует 20 аминокислот, на основе которых кодируются миллионы белков. Белки ��емных организмов бывают настолько несовместимы, что именно на белковой основе строятся смертоносные несинтетические яды. Учитывая вышеизложенное, возникает вопрос: почему земная биохимия ограничилась пятью азотистыми основаниями? Напомню, что в состав ДНК входят аденин, цитозин, гуанин и тимин, а в РНК на месте тимина используется схожее азотистое основание урацил.
Информатика подсказывает, что носитель информации действительно должен быть парным, то есть представлять собой последовательность, состоящую, как минимум, из комбинаций 0 и 1. Естественный алфавит ДНК — четырёхбуквенный, но природа не породила никаких более широких комбинаций, например, хатимодзи-ДНК. По мнению Раманараяна Кришнамурти, работающего в исследовательском центре Скриппса вместе с Ромсбергом, двухбуквенный алфавит потребовал бы выстраивать более длинные цепочки ДНК, которые бы занимали в клетке больше места и быстрее рвались, тогда как при увеличении генетического алфавита сверх 4 букв возросло бы количество ошибок при копировании. Вероятно, эволюция не поддержала не только увеличения количества нуклеотидов сверх 4, но и включение фтора в биохимические молекулы из-за чрезмерной агрессивности и достаточной редкости этого элемента.
С другой стороны, при контролируемом развитии увеличенного алфавита и искусственном культивировании клеточных культур, включающих новые нуклеотиды, достоинства такого подхода могут перевесить его недостатки. Очевидно, что расширенный алфавит ДНК располагает к синтезу более разнообразных белков, что позволило бы улучшенным организмам заселять ранее недоступные экологические ниши и открыло бы доступ к новым источникам энергии. Кроме того, в ДНК можно было бы включать такие основания, которые катализировали бы уже известные биохимические реакции и позволяли, например, дышать при сниженном количестве кислорода в атмосфере.
Искусственная ДНК также могла бы содержать инструкции и признаки, не встречающиеся в живой природе. Уже сейчас, оперируя четырьмя естественными основаниями, парфюмеры создают новые ароматы, а биохимики научились синтезировать фермент, расщепляющий глютен и помогающий лечить целиакию.
Среди наиболее амбициозных целей, которые ставит перед собой преимущественно Стивен Беннер — создание пар оснований, которые бы превосходили естественные аналоги при селективной привязке к некоторым клеткам, например к раковым. Уже доказано, что при наличии оснований P и Z такая способность противоракового препарата повышается.
Кроме того, Беннер надеется откатить биохимию на такой примитивный уровень, где она предположительно могла обходиться без ферментов. В такой ситуации ДНК могла бы служить долговременным хранилищем информации (storage), тем более, если бы это была расширенная ДНК, а перенос информации и каталитические функции полностью брала бы на себя расширенная РНК, для которой можно было бы придумать новые разновидности, наряду с современными матричным, транспортным и рибосомальным вариантами. В более широком контексте те исследования, что описаны в этой статье, могут послужить для нас предварительной подготовкой к встрече с внеземной жизнью. Они уже сейчас подводят нас к пониманию, что земная ДНК в принципе может уступать синтетическим формам в скорости распространения и информационной ёмкости, а значит — и в разнообразии генетического и белкового материала. Будем следить, к чему приведут опыты по размножению искусственных нуклеотидов в бактериальных культурах.
