Мои приключения с растениями продолжаются. Я выращиваю настоящий васаби в Москве и планирую построить для него целую ферму. Сейчас я озабочен поиском посадочного материала для своей фермы, но купить рассаду настоящего васаби в России невозможно, её нет физически. Поэтому я решил производить её самостоятельно. И не абы как, а с помощью микроклонального размножения. Для этого я из подручных средств организовал себе лабораторию, о ней и будет этот пост.
Что такое микроклональное размножение растений
Микроклональное размножение — это один из способов вегетативного размножения растений, т.е. новая особь образуется из многоклеточной части тела родительской особи. В основе микроклонального размножения лежит понятие тотипотентности, способности клетки путем деления дать начало любому клеточному типу организма. Представьте, что вы срываете ветку растения, ставите её в воду и она пускает корни. Вы создали условия, способствующие генерации новых органов. Микроклональное размножение производится в стерильных условиях, что позволяет расширить спектр возможных вариантов воздействия на ткани растения и получать новые органы из довольно неожиданных структур. Например, хризантема отлично размножается из лепестков. Или, к примеру, клетки растения можно заставить делиться без дифференцирования, получая каллус, который так же способен дать начало целому растению.
Приведу пример, как буду использовать микроклональное размножение для своих целей. Сначала я извлеку из материнских растений настоящего васаби почки, продезинфицирую их в специальном растворе, который убьёт на поверхности растения все бактерии и споры грибов, а затем в стерильных условиях помещу эти почки на специальную среду с фитогормонами и витаминами. Когда почка подрастет, я изменю гормональный состав, чтобы он способствовал генерации новых побегов.
Где-то через месяц я получу на каждой почке около трёх микро-побегов. Каждый их этих побегов можно отделить и вновь посадить на такую же среду и каждый из них через месяц снова даст около трёх побегов. А теперь посчитайте, сколько копий растения можно получить таким образом за год? 3 в 12 степени = 531441!
За этапом размножения следует этап генерации корней. Для этого побеги сажаются на среду с новым гормональным рецептом, стимулирующим корнеобразование. После того как корни будут готовы, растения отправляются на акклиматизацию, ведь они росли в стерильной среде и им нужно постепенно адаптироваться к настоящим условиям.
Почему микроклональное размножение?
Для чего такие сложности, ведь васаби можно размножать семенами и отростками?
Размножение семенами — это рабочий способ, но у него есть ряд недостатков. Семена васаби очень быстро утрачивают жизнеспособность и долго не хранятся, поэтому появляется зависимость от сезонности. Семена можно собрать и посадить раз в году в течение непродолжительного времени, а я хочу иметь возможность сажать растения в любое удобное время. Ещё одно неудобство — семена требуют стратификации (продолжительного периода охлаждения). У меня дома растет два сорта васаби и тот, что наиболее интересен за год так ни разу и не зацвёл.
Размножение отростками допустимо, и я не буду им пренебрегать. Но у него есть существенный недостаток. Отросток накапливает в себе болезни родителя и такой способ не рекомендуется проводить глубже, чем на три поколения. Микроклонирование же лишено этой проблемы, благодаря размножению в стерильных условиях. Остаются лишь вирусы, но и от них существуют техники лечения.
При микроклональном размножении я всегда буду иметь фонд посадочного материала, который легко контролируется и не зависит от внешних условий. Ну и в конце концов попробовать без какого-либо опыта организовать такую штуку — это интересно!
Помещение
У меня лаборатория распределилась по двум локациям. Некоторые вещи мне удобно делать дома, например, замешивать растворы или производить стерилизацию, ну а другие лучше там, где у меня есть свободная площадь, а именно в моей бытовке, которая осталась после клубничной фермы. Там, например, я разместил ламинарный бокс и шкаф для выращивания микро-клонов.
Ламинарный бокс
Ламинарный бокс — это главное место лаборатории. Он нужен, чтобы обеспечить стерильность проводимых работ. Достигается она за счет постоянного притока воздуха, который нагнетается че��ез фильтр абсолютной очистки. Обычно используются фильтры HEPA не ниже класса H14. На вторичном рынке возможно найти профессиональный ламинар, начиная от 150 т.р. Я же собирал самостоятельно и это значительно дешевле. Мой ламинар состоит из следующих компонентов.
Предварительный фильтр. Класс F5, размер 287х287х48
HEPA-фильтр H14, 305х610х150. У меня это самая дорогая часть ламинара. Сейчас я считаю, что толщина в 150 мм — это много. Можно было сэкономить и заказать тоньше.
Центробежный радиальный вентилятор на 800 м³/ч. Его хватает с избытком для прокачки воздуха с нужной скоростью через мои фильтры. Если у вас будут другие фильтры, советую сделать расчет производительности вентилятора. Рекомендуемая скорость потока на выходе из фильтра 0.4-0.6 м/с. Вот ссылка на видео, где подробно рассказано, как произвести расчеты.
Корпус собирался из мебельной фанеры. Спереди установил подъемную крышку из закаленного стекла.
В ламинаре есть УФ-лампа для дезинфекции. Она должна быть установлена таким образом, чтобы свет падал на рабочую поверхность. У меня мощность лампы 8 вт. Это меньше, чем в стандартных ламинарах, но компенсируется временем экспозиции. Я запускаю стерилизацию минимум на 1 час перед работой. В планах поставить лампу помощнее. Кстати, во время работы УФ-лампу не включают, а то бывают и такие.
Имеется дополнительное освещение для работы. Удобно в ламинар встроить пару розеток, чтобы подключать оборудование.
Принцип работы ламинара следующий. В боксе №1 спрятан радиальный вентилятор, который через предварительный фильтр всасывает воздух и закачивает его в бокс №2. Бокс №2 в высоту около 30 см и нужен для выравнивания давления. Бокс №3 - это короб с фильтром HEPA. После фильтра выходит очищенный воздух, в потоке которого можно работать в стерильных условиях.
Все швы у ламинара промазаны герметиком, чтобы воздух нигде не сифонил.
После запуска ламинар был протестирован на стерильность. В течение 10 минут я держал открытыми банки со стерильной питательной средой. Потом убрал их на полку и ждал, что вырастет. Не выросло ничего. Если такую банку подержать вне ламинара, то на среду попадет множество бактерий и спор грибов, которые на ней активно размножатся. Так же эффективность подтверждена уже более чем 1000 банок, в которых я пытался ввести в культуру васаби и некоторые другие растения.
Шкаф для выращивания эксплантов
Я ещё не вводил понятие экспланта. Эксплант — это группа клеток, кусочек отделенный от материнского растения, используемый для дальнейшего размножения в стерильной среде. Чаще всего такие экспланты помещаются на питательную среду в герметичные контейнеры, банки, пробирки, чашки Петри. В общем, во что угодно, что подходит по размеру, обеспечивает стерильность, пропускает свет и не портится при автоклавировании.
После того, как эксплант помещен в контейнер (ещё говорят введен в культуру in-vitro), он отправляется в большинстве случаев в шкаф для дальнейшего развития, в зависимости от гормонов, которые были использованы, например на генерацию новых побегов. Для этого экспланту нужно создать подходящие условия: обеспечить освещение 3000 люкс, поддерживать режим день/ночь, и держать температуру около 24℃. Условия могут отличаться, в зависимости от требований. Каллус (недифференцированные, потерявшие специализацию клетки), например, можно выращивать в темноте.
Для своих эксплантов я собрал стеллаж, наклеил светодиодных линеек и подобрал блок питания, чтобы обеспечить около 3000 люкс на уровне банок с эксплантами. Ну а температура в 24℃ поддерживается во всем помещении за счет кондиционера и обогревателя.
Удаленное управление
Естественно, не обошлось и без автоматизации. В этот раз я использовал Raspberry Pi + Home Assistant и готовые устройства на Zigbee. Очень удобно из дома включить УФ-лампы для дезинфекции, а затем проветрить помещение, запустив принудительную вентиляцию. А так же включить сухожар для дезинфекции инструмента. По приезду в лабораторию, всё уже готово к работе.
Отделение для акклиматизации эксплантов
Когда у эксплантов будут выращены все органы, их можно перемещать из стерильной среды в наш агрессивный мир со всеми его вирусами, бактериями и грибами. Чтобы этот переход был мягче и больше эксплантов выжило, им сначала создают промежуточные условия. Экспланты отмываются от желеобразной среды и пересаживаются на стерильный субстрат. Влажность в самом начале обычно высокая и затем постепенно снижается, растения переводятся на слабое минеральное питание. В отделении акклиматизации стерильность уже не поддерживается, но чистота важна.
Оборудование
Автоклав
Автоклав нужен для стерилизации предметов и веществ, используемых в лаборатории. У меня самый частый пациент на автоклавирование — это среда, на которой растения вводятся в стерильную культуру. За счет нагрева во��яного пара под давлением увеличивается температура и, соответственно, скорость и качество стерилизации. При температуре 121°C достаточно 15 минут, чтобы получить стерильную среду.
В качестве автоклава можно использовать скороварку или мультиварку с режимом скороварки. Но у них небольшой объем. Для меня оптимальным вариантом оказался бытовой автоклав, какие используют для консервирования продуктов и модифицируют под варку самогона. Я купил самый дешевый вариант с ТЭНом и повесил на него регулятор напряжения.
Если объема бытового автоклава мало, можно обратиться к интернет-барахолкам и найти что-то под себя, например, советские ВКУ-50 или ВК-75.
Стерилизация методом фильтрации
Не все жидкости можно нагревать без потери свойств. Например, фитогормоны и витамины автоклавировать не стоит. Для их стерилизации пользуются методом фильтрации. Например, мембранный фильтр на 0,22 мкм способен задержать большинство бактерий и грибов. Сначала я пользовался вот таким аппаратом:
Где синяя ручка закладывается мембранный фильтр, а затем из нижней части откачивается воздух, заставляя жидкость проходить через фильтр. Аппарат неудобен тем, что он большой и перед работой его самого надо простерилизовать. И без мытья нельзя другую жидкость прогнать. А мыть в стерильных условиях неудобно, если вообще имеет смысл. Но есть решение! Одноразовые фильтры на шприц. Стоят недорого и крайне удобны в использовании. После них я забыл про фильтровальный аппарат.
Магнитная мешалка с подогревом
Очень полезная вещь, когда нужно что-то в чем-то растворить или постоянно перемешивать. Для нее можно купить магнитных якорей разных размеров, под любую тару. Хотя я использую только два размера - тот, что на фото для объемов 0.1 - 2 л и совсем малюсенький для мелкой тары.
Микроскоп
У меня их два. Первый - это стерео-микроскоп 7x-50x для работы с мелкими частями растения. У него достаточно пространства под объективом, чтобы комфортно работать пинцетом и скальпелем, а бинокулярность помогает ориентироваться в пространстве. Например, достать у растения меристему без такого микроскопа будет очень сложно.
Второй микроскоп с увеличением до 1000x, чтобы было видно грибы и бактерии. Мне он нужен для помощи в борьбе с внутренним бактериальным заражением эксплантов.
Естественно, если вы не знаете пока, как именно будете применять микроскоп, то раньше времени его покупать нет смысла. Оба микроскопа я брал на алиэкспрессе и ни о чем не жалею. Пока изучал микроскопную тему, пришел к выводу, что по соотношению цена/качество это лучший вариант.
Пипетатор
Очень удобный прибор для точного дозирования небольших объемов жидкостей. Позволяет работать в стерильных условиях за счет сменных наконечников. Я его использую в основном для добавления фитогормонов в питательную среду. У меня в ходу прибор с рабочим диапазоном 10-100 мкл. Покупал на маркетплейсе китайский вариант относительно недорого. Делал замеры, как работает прибор. Погрешность не критическая, в соответствии с паспортом. Пипетатор можно заменить инсулиновыми шприцами на 0.3 мл, но прибор всё же точнее и в глобальной перспективе выгоднее за счет копеечной стоимости одноразовых наконечников.
Очистка воды
При приготовлении различных растворов, важно, чтобы вода не содержала примесей, которые могут непредсказуемо прореагировать с растворяемыми веществами или оказать негативное влияние на экспланты. Проще всего для очистки воды собрать установку на основе обратного осмоса. Например, взять обычную бытовую, состоящую из предфильтров и обратноосмотической мембраны и выкинуть минерализатор.
Мерная посуда
Мерной посуды у меня много разной, хотя самая ходовая - колбы на 0.5 л, в них я автоклавирую питательную среду и емкости на 2 литра, в которых что-то часто замешиваю. Так же всегда в ходу шприцы самых разных мастей
Весы
У меня есть кухонные весы для крупных навесок и 3 ювелирных: до 50 гр, до 200 гр и до 500 гр. Самые ходовые на 200 гр.
Скальпель и пинцет
Неразлучные друзья для работы с эксплантами. Скальпель лучше всего иметь со сменными лезвиями. Они достаточно быстро портятся во время работы, когда приходится их стерилизовать в пламени спиртовки после каждого отреза. Кстати, из-за стерилизации под огнем удобнее работать сразу двумя наборами скальпель-пинцет. Стерилизация после каждого отреза утомляет, так еще и дождаться надо, пока приборы остынут. Поэтому удобно чередовать - одними работаешь, другие остывают.
Спиртовка
Спиртовку я использую для дезинфекции скальпеля и пинцета, концы которых окунаю в спирт и затем обжигаю в пламени. Во время работы с растениями рекомендуется проводить дезинфекцию после каждого отреза, чтобы не размазывать заразу, если она случайно попадется при работе.
Сухожар
Это такая электро-духовочка для стерилизации предметов. После завершения работы я убираю в нее инструмент. А когда планирую поработать в следующий раз, то удаленно включаю за час до начала использования.
pH-метр
pH рабочих жидкостей не всегда соответсвует требованиям и его необходимо корректировать. Например, я самостоятельно изготавливаю среду Мурасиге-Скуга, и изменяю её pH в соответствии с протоколом микроразмножения.
В серьёзных лабораториях обычно используются дорогие устройства, но и точности простых бытовых pH-метров вполне хватает. Тем не менее, я взял себе за правило калибровать прибор перед каждым использованием в случаях, где особенно важна точность.
Холодильник
Многие вещества лучше хранить в холодильнике, а другие в морозильной камере. Например, я заранее приготовил стерильных растворов фитогормонов, витаминов и антибиотиков. Сначала я держал всё в отдельном углу семейной морозилки, но быстро принял решение обзавестись отдельным холодильником под свои нужды. Так спокойнее и за семью и за вещества.
Пульверизатор
Брызгалку я использую постоянно. В ней у меня залит 70% спирт. Обрабатываю ей рабочие поверхности и предметы, которые вношу в стерильный бокс. А еще руки во время работы в стерильных условиях.
Расходники
Спирт
Без спирта никуда. В первую очередь это дезинфецирующее средство, причем не только для рабочих поверхностей, но и для эксплантов. Это и топливо в спиртовках и возможный растворитель для некоторых фитогормонов. Очень жаль, что ограничена свободная продажа, но ищущий да обрящет.
Вода
Имеется в виду вода без примесей, деионизированная. Выше я писал как её можно получить.
Среды для растений
Существует множество различных сред, самая популярная из них — Мурасиге-Скуга (MS). На самом старте я рекомендую покупать готовые среды проверенных производителей. Я на этом обжегся, когда свою первую среду купил на алике. Месяцы экспериментов были потрачены впустую из-за того, что экспланты гибли на этой среде, а я не понимал почему.
Если чувствуете в себе силы, то среду несложно приготовить самостоятельно из навесок солей. Все соли есть в свободной продаже, а рецепты доступны в сети. На фото ниже набор моих солей для приготовления основы среды MS.
Кроме минеральных солей в состав сред входят витамины. Их тоже можно смешать самостоятельно. Но если купить профессиональную смесь, например, такую, то её хватит надолго и стоит она не дорого, а в цепочке производства будет исключен рискованный элемент.
Фитогормоны
Используются в микроскопических дозах. К примеру, 1 г гормона 6-БАП (6-Бензиладенин, 6-Benzylaminopurine) хватит на 1000 литров среды при довольно сильной концентрации в 1 мг/л. В сети один ресурс, где продают гормоны за дешево физлицам, но у меня нет уверенности, что там товар качественный или хотя бы рабочий. Буду очень признателен, если кто-нибудь расскажет в комментариях о своем опыте с фитогормонами от greenagrolab. Я пока боюсь их использовать и через ИП закупился у проверенного поставщика.
Баночки
Тара для жизни кусочков растений в стерильных условиях подбирается индивидуально, в зависимости от размеров и подхода. У меня сейчас самая ходовая единица - пластиковые соусники на 30 мл. т.к. почти все мои экспланты имеют бактериальное заражение, я их сажаю изолированно в маленькие баночки, чтобы не заразили друг друга. Как только мне удастся получить здоровый экземпляр, я возьму тару покрупнее и буду сажать по несколько единиц в банку.
Пакеты для автоклавирования
Существуют самых разных размеров. После автоклавирования предмет надо как-то в стерильном виде доставить до ламинарного бокса. Поэтому он автоклавируется в специальном пакете.
Фольга
Используется для тех же целей, что и пакет для автоклавирования. Предмет перед отправкой в автоклав плотно заворачивается в фольгу, а при внесении предмета в ламинар фольга снимается.
Пробирки типа Эппендорф
На 1.5 мл. В них удобно порционно разливать стерильные растворы фитогормонов, чтобы, в случае заражения или порчи не пострадал большой объем.
Наконечники для пипетатора
Наконечники одноразовые. Стоят недорого. Можно купить, например, пакет на 1000 штук и долго не переживать, что закончатся. Удобно купить к ним штатив, чтобы герметичный был и выдерживал стерилизацию в автоклаве. Наконечники обычно продают не стерильными. Обычно заряжают такой штатив и автоклавируют.
Шприцы
Шприцы расходуются у меня активно. Удобно, что они стерильны. Шприцами я постоянно что-то отмеряю, переливаю или отсасываю. И даже один раз при помощи шприца пробовал заниматься вакуумной инфильтрацией, чтобы доставить вещество в ткани растения.
Сменные насадки скальпеля
У меня в ходу ручка скальпеля хирургическая №3 и сменные одноразовые лезвия №11 к ней.
Средства для дезинфекции эксплантов
Чтобы выращивать эксплант в стерильной среде, он и сам должен быть стерильным. Существует множество средств для стерилизации поверхности эксплантов. В большинстве протоколов микроклонального размножения указывается, какие средства были использованы. Самое популярное вещество — гипохлорит натрия. Содержится в белизне и её можно использовать. Работая с ней надо очень аккуратно подбирать концентрацию, т.к. содержание гипохлорита натрия сильно плавает у разных производителей. И не факт, что от партии к партии будет одинаковой. Вот есть прекрасный пост о белизне.
Среди прочего может использоваться спирт (чаще как предварительная обработка до основной стерилизации), перекись водорода, хлорид ртути (сильный яд, лучше не иметь с ним дело, когда есть альтернативы) и т.д.
Я же подсел на самодельный аналог средства Plant Preservative Mixture (PPM™). В его составе биоцид, который в слабых концентрациях убивает бактерии и грибы и в то же время достаточно щадящим образом относится к тканям растений. В целях профилактики заражений это средство даже можно добавлять в среду к растениям и оно не теряет своих свойств при автоклавировании.
Что дальше, если заинтересовала тема?
О том, как конкретно заниматься микроклональным размножением в сети полно информации. Можно поизучать немного теории. На ютубе много видео с процессом работы. Внимательно смотрите и учитесь. Там ничего сложного.
Если у вас есть желание размножать конкретное растение, то наверняка до вас уже это кто-то делал. И скорее всего для этого растения в сети найдется не один протокол микроразмножения и написана уже не одна научная статья о том, как его клонировать. Особенно в англоязычном сегменте интернета.
Уделяйте особое внимание стерильности и правилам работы во время размножения. Я рекомендую отдельно на эту тему погуглить, поспрашивать у дипсика и чатагпт, как делать правильно и на что обратить внимание. В видеороликах тоже об этом рассказывают.
Качество препаратов в микроклональном размножении играет важную роль. Если покупаете дешевый аналог, то как минимум надо провести одновременное сравнение с качественным препаратом, и только если не видно разницы, то зачем платить больше, а иначе лучше платить.
Точность имеет большое значение. На каждом этапе нужно тщательно следить, что было отмерено нужное количество вещества, что pH среды действительно соответствует требованиям и хотя бы один раз проверить, как он меняется после автоклавирования (а он меняется) и учитывать это в будущем. Отклонения от нормы вредят эксплантам.
Думайте о своей безопасности. В научных статьях частенько можно встретить применение опасных для здоровья веществ. Многие без проблем можно купить в сети. Если пробуете что-то новое, убедитесь, что оно вам не навредит.
Какие успехи у меня
Микроклональное размножение васаби
На фото эксплант васаби, выросший из кусочка тканей, размером не больше 1 мм. К сожалению, он заражен и скорее всего скоро погибнет. Материнские растения, из которых я беру образцы для введения в культуру имеют внутреннее бактериальное заражение с которым я не могу пока справиться. Борьба с заражением — это тема для отдельного поста. Я провел уже более 50 экспериментов, пробовал и различные антибиотики и меристему доставать и много чего ещё. Пока все мои попытки заканчиваются неудачей, но если посмотреть на весь прогресс от первой попытки до последней, то я здорово прокачался в работе с бактериальным заражением. Буду работать дальше. Я не оставляю надежды побороть заразу.
Клубника
А вот с клубникой всё получилось с первой попытки. На фото выше 5 банок. Изначально я посадил в банки 5 семечек. Благодаря фитогормонам они раскустились и имеют маленький размер. Эти кустики я разделил на микро розетки и рассадил. Теперь у меня 60 банок. Такими темпами в следующий раз должно получиться 720. А дальше по геометрической прогрессии.
Понятия не имею, что я буду делать с такой кучей растений. Если у кого-то есть интерес к здоровой рассаде топовой клубники Delizzimo F1, пишите, договоримся.
Скоро буду пробовать подбирать для эксплантов гормоны для генерации корней, а затем высаживать на адаптацию к жизни в обычных условиях.
Плесень для сыра
Я очень люблю сыр с плесенью. После ухода в 2014 году с российского рынка иностранных сыров с голубой плесенью никто до сих пор не научился его делать нормально. По крайней мере в обычных магазинах невозможно купить достойной продукции. Есть контрабанда. Однажды я купил вкусный контрабандный итальянский сыр и загорелся идеей достать из него плесень и сделать свой собственный сыр. Ведь у меня же есть лаборатория, в которой я смогу выделить культуру плесневых грибов Penicillium roqueforti из этого сыра и выращивать её. Сказано - сделано! Теперь у меня растет голубая плесень.
Молочнокислые бактерии тоже можно выделить из сыра, но тут работка посложнее, т.к. в вызревании сыра с голубой плесенью участвует 3-4 вида бактерий и их нужно идентифицировать и разделить. Я оставил это до лучших времен и купил пока готовую бактериальную закваску. И вот у меня к Рождеству целая куча собственноручно приготовленного сыра с голубой плесенью.
Тема оказалась очень интересной. В первой версии сыра я уже выделил несколько вещей, над которыми надо поработать и у меня уже вызревает 4 новых разных версии сыра и ещё 2 эксперимента запущу вот-вот.
Итого
Лаборатория функционирует прекрасно, я счастлив. Основная задача, ради которой это всё затевалось до сих пор не решена. У меня всё ещё нет посадочного материала для моей васаби-фермы. Но зато появились побочные квесты, где тоже можно прокачаться. А с бактериальным заражением эксплантов я рано или поздно разберусь.
О дальнейшей судьбе васаби, сыра и клубники следите на моем канале.
