По всему миру сельское хозяйство сталкивается с ростом потребности в продуктах питания и ограниченностью водных ресурсов. Эффективность выращивания культур во многом зависит от того, насколько точно удаётся описывать и предсказывать процессы, определяющие фотосинтез и потерю воды у растений. Одну из ключевых ролей здесь играют устьица, микроскопические поры на поверхности листьев, которые регулируют поступление CO₂ и испарение влаги.
В 2025 году исследователи из Иллинойсского университета в Урбане-Шампейне представили систему Stomata In-Sight, которая объединяет конфокальную микроскопию, газообменные измерения и автоматизированный анализ изображений на основе ML. Такой подход позволяет получать количественные оценки геометрии устьиц в условиях контролируемой среды и сопоставлять их с измеряемой проводимостью и фотосинтезом. Это важно не только для физиологии растений, но и для прикладных задач, связанных с эффективностью использования воды и устойчивостью урожая при засухе. В этой статье я расскажу о самом исследовании и о том, как устроена Stomata In-Sight.
Устьица и их роль
Устьица – это микроскопические поры на поверхности листа, образованные двумя замыкающими клетками. Они открываются и закрываются за счёт изменения тургора этих клеток и тем самым регулируют газообмен и испарение влаги через поверхность листа. Через устьица лист получает CO₂ для фотосинтеза и через них же теряет воду при испарении. Поэтому их состояние напрямую связано и с фотосинтезом, и с водопотреблением.
Апертура пор меняется быстро и чувствительна к условиям среды. Если при наблюдении не контролировать освещённость, влажность, температуру и CO₂ так же строго, как в газообменных измерениях, устьица могут уход��ть в другое состояние за секунды и минуты. Тогда изображение и физиологические показатели оказываются про разные состояния листа.
Что не так с традиционными методами изучения устьиц
Возникает вопрос, как получать изображения устьиц в контролируемых условиях и одновременно измерять газообмен так, чтобы геометрию пор можно было сопоставить с проводимостью и фотосинтезом на одном и том же материале? Обычно этого не получается по одной причине. Микроскопия и газообмен решают разные задачи и предъявляют разные требования к постановке эксперимента.
Микроскопия позволяет напрямую увидеть устьица, но условия на микроскопическом столике трудно удержать такими, чтобы они оставались физиологически релевантными. Если среда вокруг листа не контролируется жёстко, устьица могут закрываться или менять состояние за секунды и минуты. В этот момент изображение перестаёт соответствовать тому состоянию, которое хотелось бы измерить.
Газообменные системы, наоборот, хорошо контролируют режим для листа и дают воспроизводимые интегральные показатели. Но платить за это приходится усреднением. Измерение проводимости отражает средний эффект очень большой популяции устьиц на участке листа. При таком подходе не видно, как распределены апертуры по поверхности, и приходится опираться на допущение, что распределение пространственно однородно и близко к нормальному. Если это не так, интерпретация реакции проводимости на внешние и внутренние факторы становится ненадёжной.
И есть ещё одна причина, почему подобных исследований так немного. Распределения апертур и их связь с проводимостью публиковались лишь в отдельных работах, потому что прямое измерение апертур в контролируемых условиях само по себе затруднительно, а совместить его с газообменом ещё сложнее. Поэтому в обычной схеме либо получают физиологические цифры без прямой привязки к геометрии устьиц, либо получают геометрию без уверенного соответствия текущему режиму газообмена.
Устройство и возможности Stomata In-Sight
Stomata In-Sight был разработан для количественного анализа устьиц так, чтобы данные микроскопии можно было сопоставлять с газообменными измерениями. Система объединяла конфокальную микроскопию, газообменную камеру и программный конвейер анализа изображений на основе машинного обучения. В такой схеме изображения устьиц собирались параллельно с регистрацией фотосинтеза, транспирации и устьичной проводимости в контролируемых условиях.
Оптическая часть обеспечивала съёмку устьиц с разрешением, достаточным для выделения поры и компонентов устьичного комплекса. В установке использовалась двухфотонная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, а визуализация строилась на автофлуоресценции тканей. Изображения собирались в виде Z-стеков и затем сводились в двумерные изображения через проекцию максимальной интенсивности. Основной анализ проводился на устойчивых режимах при разных сочетаниях освещённости и CO₂.
Отдельным компонентом был программный модуль, который превращал изображения в численные параметры. Для автоматизированного анализа использовалось браузерное ML-ПО Biodock. Модель сегментации обучали выделять несколько типов объектов: устьичные поры, устьичные комплексы целиком, замыкающие и вспомогательные клетки. После сегментации для каждого объекта автоматически рассчитывались геометрические характеристики, включая площадь, длину и ширину.
Начальная версия модели обучалась на 62 изображениях поверхности листа с ручной разметкой контуров всех интересующих структур. Всего было сделано 1304 разметки, включая 227 устьичных комплексов, 445 замыкающих клеток, 428 вспомогательных клеток и 204 поры. Из этого набора 55 изображений использовались для обучения, а 7 для тестирования. Во время обучения применялись преобразования изображений, которые увеличивали разнообразие данных. Отражения по горизонтали и вертикали, повороты, масштабирование, изменения яркости и контраста. Дополнительно применялась нормализация контраста, чтобы уменьшить чувствительность модели к вариациям условий съёмки.
Для независимой проверки качества сегментации и измерений использовался набор из 19 изображений от 9 растений, который не входил в обучение и охватывал диапазон плотности устьиц и условий обработки. Один оператор вручную обводил устьичные комплексы и их компоненты в ImageJ и сохранял разметку как области интереса. Затем сравнивались геометрические параметры, полученные вручную, и параметры, рассчитанные в Biodock для сопоставленных объектов.
В результате ML-модуль стал частью экспериментального конвейера. Он позволял получать параметры устьичных структур на сериях изображений без ручной разметки каждого кадра и использовать эти параметры вместе с данными газообмена в рамках той же экспериментальной серии. Это дало возможность работать не с отдельными примерами, а с распределениями устьичных параметров в заданных условиях среды.
Как проводился эксперимент
Эксперимент был выстроен так, чтобы одновременно измерять газообмен листа и снимать устьица под конфокальным микроскопом, удерживая условия среды стабильными. В качестве объекта использовалась кукуруза Zea mays, генотип B73. Растения выращивались в теплице в 6-литровых горшках. Температуру поддерживали на уровне 28 °C днём и 22 °C ночью, фотопериод составлял 16 часов с дополнительным LED-освещением.
Ключевым узлом установки стала газообменная камера, совместимая с газообменной системой LI-6800, которая измеряет фотосинтез, транспирацию и устьичную проводимость в контролируемых условиях. Её спроектировали как прижимную конструкцию из двух частей, чтобы измерять газообмен только с абаксиальной стороны листа и при этом вести конфокальную съёмку устьиц прямо в камере. Нижнюю часть изготовили из алюминия и снабдили прозрачным окном из покровного стекла для съёмки снизу. Расстояние от окна до поверхности листа держали в пределах рабочей дистанции объектива 13 мм.
Чтобы избежать градиентов CO₂ и водяного пара между сторонами листа, другую сторону листа также снабжали контролируемой подачей газа, хотя измерения проводились только с абаксиальной стороны. Рабочие параметры были такими: на абаксиальную сторону листа подавали поток 500 µmol s−1, на адаксиальную подавали референсный газ 200 µmol s−1. CO₂ удерживали на уровне 420 ppm, температуру воздуха 28 °C, относительную влажность 70%.
Внутри камеры использовалось перемешивание воздуха, но вентиляторы давали вибрации, которые мешали стабильной съёмке. Конструкцию дорабатывали механически и развязывали вибрации, в том числе за счёт подвеса головы LI-6800 на амортизирующем подвесе. В итоге режим работы вентилятора выбирали так, чтобы сохранить перемешивание и не потерять качество изображения. Вентилятор ставили на 40% от его мощности, и проверяли, чтобы в этом режиме изображения оставались пригодными для анализа.
Съёмка выполнялась на лазерной сканирующей конфокальной системе с двухфотонным возбуждением, используя автофлуоресценцию тканей. Изображения снимали в формате Z-стеков. Это серия кадров на разных глубинах по толщине ткани. Затем стек сводили в одно двумерное изображение с помощью проекции максимальной интенсивности. Измерения начинали только после того, как лист успевал стабилизироваться в заданных условиях, чтобы газообменные показатели не менялись из-за переходного режима. Дальше лист последовательно переводили через пять состояний. Сначала темнота при 420 ppm CO₂, затем свет при 420 ppm, потом снижали CO₂ до 150 ppm, затем повышали до 750 ppm и в конце возвращались к 420 ppm. Эту последовательность повторили на 10 растениях, разделив эксперименты на два блока.
Результаты исследования
Эксперименты дали связку данных, где газообмен и изображения устьиц относились к одному и тому же режиму. За счёт этого стало возможным смотреть не только на интегральные показатели листа, но и на распределение апертур устьиц внутри измеряемой области, не сводя всё к одной усреднённой величине.
Автоматический анализ изображений оказался пригодным для количественных измерений. Модель стабильно находила устьичный комплекс и его части и считала их размеры. При сравнении с ручной разметкой результаты в целом совпадали, хотя для некоторых параметров было заметно небольшое, но постоянное смещение. Это важно потому, что смещение не «плавало» от кадра к кадру и от режима к режиму, поэтому по этим данным можно было сравнивать условия между собой.
Отдельно стало видно, насколько важен объём выборки. Внутри одного листа устьица заметно различались, поэтому при малом числе измеренных пор средние значения и форма распределения получались нестабильными. Чтобы надёжно описывать апертуры, приходилось измерять не единицы и не десяток устьиц, а существенно больше.
При смене условий среды изменения в газообмене сопровождались согласованными изменениями в геометрии пор. В темноте устьичная проводимость падала почти до нуля и большинство пор закрывались. При включении света и при снижении CO₂ устьица в среднем раскрывались сильнее и проводимость росла. При повышении CO₂ проводимость снижалась, распределение апертур смещалось к меньшим значениям, но сохранялась вариативность, и часть устьиц оставалась заметно открытой.
Измеренные геометрические параметры использовали для расчёта устьичной проводимости по анатомической модели и сравнили её с проводимостью из газообмена. Согласование получилось хорошим, а небольшое систематическое расхождение связывалось с тем, как автоматический конвейер оценивал площадь апертуры.
Практическое значение результатов
Исследователи показали, что морфологию устьиц и их проводимость можно согласовать в одной системе измерений. Интеграция конфокальной микроскопии с газообменной камерой позволила напрямую сопоставлять размеры апертур и плотность устьиц с измеряемыми показателями фотосинтеза и транспирации в тех же условиях.
Автоматизированный конвейер анализа изображений сделал возможной обработку больших наборов микроскопических данных без ручной разметки каждого кадра. Машинное обучение стабильно выделяло устьичный комплекс и его компоненты и возвращало измеряемые параметры, пригодные для сравнения между режимами. За счёт этого стало возможно не ограничиваться описанием отдельных примеров, а переходить к количественным оценкам и проверке моделей. В частности, устьичную проводимость удавалось оценивать по независимым анатомическим параметрам, включая размеры пор, плотность устьиц и глубину поры, и затем сопоставлять эту оценку с газообменными измерениями.
Прикладной смысл такой связки в том, что она даёт инструмент для работы с признаками, связанными с эффективностью использования воды. С его помощью можно проверять, какие изменения в устьичной анатомии действительно соответствуют нужным изменениям проводимости и транспирации, а какие нет. Кроме того, этот подход помогает разбирать механизмы компенсации, когда при разной плотности устьиц растения могут приходить к сходным значениям проводимости за счёт различий в размерах и поведении пор. Всё это напрямую связано с задачами повышения устойчивости культур к засухе и другим стрессовым условиям.
Вместо заключения
Stomata In-sight в этом исследовании была прежде всего измерительной схемой. Она позволила получать геометрию устьиц и газообменные параметры в одном режиме среды и сводить их в одну систему данных. Это создаёт основу для проверки анатомических моделей проводимости на сопоставимых измерениях и для накопления серий, которые можно сравнивать между культурами и условиями.
Размещайте облачную инфраструктуру и масштабируйте сервисы с надежным облачным провайдером Beget.
Эксклюзивно для читателей Хабра мы даем бонус 10% при первом пополнении.
