Как постулирует Второй Закон Термодинамики (великий и ужасный), без притока свободной энергии любая сложная система быстро деградирует и никакая движуха в ней становится невозможна. Естественно, бактериальные клетки не исключение. Поэтому, рассмотрение процессов, происходящих в ней, имеет смысл начать именно с энергетического аспекта.

При этом, нужно сразу отметить, что сравнительно просто устроенные клетки без ядра, являющегося основным отличительным признаком для более сложно устроенных эукариот, в свою очередь, делятся на два больших домена - бактерий и архей. У них много общего, но есть и существенные отличия. Мы будем говорить, в основном, про бактерий, как более хорошо известных широкой публике и к настоящему времени лучше изученных (археи открыли сравнительно недавно, в 1977 году), но иногда, при необходимости, я предполагаю вкратце рассказывать и про архей.

Итак, на чем основана практически вся энергетика бактерий и архей на самом нижнем уровне? Ответ прост - на электрическом токе. Внутри клетки масса электронов все время спешит от молекулы-источника к молекуле-приемнику, имеющей более высокий, чем у источника, потенциал, по пути обычно совершая какую-то полезную для клетки работу или запасая энергию впрок. Наиболее универсальная энергетическая "валюта", это молекулы ATP. Они, как конденсатор, периодически то разряжается, теряя один фосфат (PO₄) и отдавая при этом энергию для какие-то важных биологических реакций, то обратно заряжается от других источников энергии. При этом, сама свободная энергия, которая в нужный момент может быть использована для совершения полезной для клетки работы, аккумулируется в фосфоангидридной связи между вторым и третьим фосфатами молекулы ATP. Данную связь можно сравнить с заряженным ружьем - стоит в нужный момент произвести небольшое усилие, нажав на курок, и из дула вылетит пуля, имеющая кинетическую энергию на порядки большую, чем усилие пальца, нажимающего на спусковой крючок.

Молекула ATP. Содержащие запас свободной энергии фосфоангидридные связи показаны красным цветом. Взято с сайта Науколандия.

Но ATP это, так сказать, мелкая валюта, типа на карманные расходы на текущий день. Для более длительного хранения энергии из фосфатов формируются длинные, содержащие до нескольких тысяч атомов фосфора, цепочки (полифосфаты), которые хранятся в специальной "копилке" - асидокальциосоме. Такие цепочки можно наглядно представить в виде бусинок в ожерелье. Когда наступают трудные времена, копилку открывают, и начинают отщипывать от ожерелья бусинки, причем каждый отщепленный фосфат при этом содержит запас энергии, соответствующей одной молекуле АТФ.

Наиболее часто встречающаяся в живых организмах циклическая форма глюкозы. Взято из Википедии.

Более крупной купюрой энергетической валюты является глюкоза. Разбирая на части одну ее молекулу даже в восстановительной внешней среде можно "зарядить" сразу две молекулы ATP, а уж в присутствии кислорода разборка глюкозы на составляющие (воду и углекислый газ) позволяет синтезировать до 32-х (!) молекул ATP. При этом, отдельные молекулы глюкозы могут, в свою очередь, объединяться в гигантские разветвленные цепочки, образуя, тем самым, суперкомплекс - гликоген. В таком комплексе, представляющем собой как бы некий склад энергетиков, может храниться до 100 000 молекул глюкозы. Тут, пожалуй, можно говорить уже не о копилке, а о полноценном сейфе!

Наконец, еще одним очень важным способом запасания энергии является ионный мембранный потенциал. Несколько упрощая, можно сказать, что в основе мембраны бактерий лежат два слоя фосфолипидов. Каждая молекула фосфолипида, в свою очередь, представляет из себя конструкцию, состоящую из содержащей фосфат (отсюда и его упоминание в названии) гидрофильной "головы" и пришитых к ней двух длинных углеводородных гидрофобных "хвостов".

Бактериальная мембрана, состоящая из фосфолипидов. Слева - общее устройство бактериальной мембраны, состоящей из фосфолипидов. Справа - устройства одной типичной молекулы фосфолипида. Взято из Википедии.

В обоих слоях мембраны (наружном и внутреннем) фосфолипиды ориентированы гидрофильной головой наружу, то есть, соответственно, к внешней среде и цитоплазме клетки, а их гидрофобные хвосты примыкает друг к другу (см. рисунок). Через такую мембрану без посторонней помощи ни положительно заряженные протоны и ионы металлов, ни электроны проникнуть не могут. Благодаря этому мембрана может держать как электрический, то есть, связанный с суммарной разностью электрических зарядов, так и химический, то есть, связанный с разностью концентрации молекул одного и того же вещества, потенциалы. Бактерии используют для сохранения энергии в виде мембранного потенциала, в основном, протоны и ионы натрия Na⁺. При этом, как показывают некоторые исследования, использование ионов натрия предшествовало использованию ионов водорода, то есть, протонов. Это вполне логично, так как удерживать натриевый потенциал проще, и для этого могли подходить и более примитивные мембраны, чем те, которые держат и протонный потенциал.

Энергия, обеспечиваемая мембранным потенциалом, может быть легко использована клеткой в любой момент, для этого достаточно открыть специальные каналы для проводки ионов, которые формируются с помощью встроенных в нее протеинов. Данные каналы пересекают мембрану насквозь, и, фактически, только через них ионы и могут пройти через нее и попасть в цитоплазму клетки. Кинетическая энергия движения прущих через эти каналы ионов может быть использована клеткой различными способами, например, для синтеза упомянутых выше молекул ATP или вращения жгутика, обеспечивающего подвижность бактерий в водной среде. По сути, такой процесс можно уподобить работе гидроэлектростанции, которая вырабатывает электрическую энергию за счет направления напора воды, возникающего из-за перепада высот в том месте, где находится электростанция, конкретно на роторы турбин, вырабатывающих электрический ток (все уже придумано до нас!).

Теперь, после краткого введения, мы готовы рассмотреть две, по-видимому, самые древние метаболические цепочки живых организмов, возникшие более 4 млрд. лет назад - ацетогенез и метаногенез. Начнем с ацетогенеза, свойственного наиболее архаичным бактериям. Суть этой цепочки в том, что при наличии в среде углекислого газа (он растворяется в воде очень хорошо, так что, с этим, как правило, проблем нет) и водорода они реагируют друг с другом, в результате чего получается уксусная кислота и две молекулы воды:

2CO₂ + 4H₂ => CH₃COOH + 2H₂O

Но в физиологических условиях большинство молекул уксусной кислоты сразу же теряют один протон, так что, в итоге получаем тот самый ацетат CH3COO^- и ушедший в свободное плавание в воде протон H⁺. Как же бактериям удается выжать из этой реакции немного свободной энергии? Как уже было упомянуто выше, большая часть энергетики клетки основана на электрическом токе. Но свободных электронов в воде, которая составляет львиную долю содержимого цитоплазмы клетки, попросту нет. Следовательно, их нужно как-то добывать, отрывая от молекул внешней среды. Если в ней в ощутимых концентрациях присутствует водород, выделяющийся, например, в районе геотермальных источников, а так же в результате жизнедеятельности других живых организмов, то он сразу становится самым легким источником свободных электронов.

Разлагать молекулярный водород на электроны и протоны помогают специальные ферменты - гидрогеназы. В их каталитическом центре обычно находятся два атома металлов - либо никеля и железа (Ni-Fe), либо двух атомов железа (Fe-Fe). С помощью этих атомов молекула водорода может претерпеть энергетически выгодную, но в неживой природе крайне маловероятную трансформацию, в результате которой оба ее электрона перескакивают на атомы металлов, а оба протона, в свою очередь, уходят в воду.

При этом, если дальнейшая судьба протонов может быть разной, то электроны в большинстве случаев устремляются по направлению градиента потенциала по проводам, образованным железосерными кластерами 4Fe-4S, к месту своего конечного назначения. В нашем случае это фермент, восстанавливающий углекислый газ до формиата (HCO₂^-) - формиатдегидрогеназа. В активном центре данного протеина находится кофактор с мало что говорящим непосвященным в глубины молекулярной биологии названием Mo-bisPGD (расшифровывается как molybdo-bis pyranopterin guanine dinucleotide). Выглядит он, на первый взгляд, довольно пугающе (см. рисунок), но, на самом деле, все не так уж сложно.

Молибдо-бис пираноптерин.гуанин динуклеотид - важнейший кофактор формиатдегидрогеназы. Нуклеотид GMP обведен красным цветом, синтезированный из его близкого родственника GTP птерин - синим. Адаптировано с рисунка на сайте www.researchgate.net

Сабж состоит из двух одинаковых частей, удерживающих в его центре с помощью четырех атомов серы атом молибдена (у некоторых организмов он может быть заменен на родственный ему по свойствам вольфрам, но мы, для простоты изложения, будем всегда говорить о молибдене, подразумевая, что это может быть и вольфрам). Сами эти части, в свою очередь, представляют из себя соединенные фосфатом пираноптерин и стандартный нуклеотид, входящий в состав РНК - гуанозинмонофосфат (GMP). Более того, пираноптерин это производная от птерина, очень широко использующегося живой природой в составе самых древних коферментов.

Ну а сам птерин, в свою очередь, синтезируется все из все того же GMP, актированного двумя дополнительными фосфатами - GTP. Итак, используя в качестве затравки один из четырех стандартных нуклеотидов РНК, всего за несколько шагов мы получаем в итоге довольно сложный и эффективно работающий кофермент. Кстати, название нуклеинового основания, входящего в GMP - гуанин вам ничего не напоминает? Ну да, оно действительно произошло от слова гавн..., сорри, гуано, то есть экскременты морских птиц, в котором его в 19 веке впервые и обнаружили.

Попутно отметим, что рассмотренная выше основная энергетическая молекула жизни ATP тоже включает один из стандартных нуклеотидов, но уже другой - аденозинмонофосфат (AMP), и это, очевидно, не случайно. В дальнейшем мы увидим еще не один пример использования стандартных нуклеотидов в составе кофакторов протеинов. Вполне возможно, что они начали использоваться жизнью еще до появления мира РНК!

Однако, вернемся формиатдегидрогеназе и ее активному центру. Помимо четырех атомов серы, принадлежащих двум пираноптеринам, атом молибдена в нем фиксируется так же серой от остатка аминокислоты цистеина (или селеноцистеина) и не принадлежащим ни одному из пираноптеринов еще одним дополнительным атомом серы. Итого - шесть атомов серы (или пять атомов серы и один атом родственного ей селена) на один атом металла, думаю, это рекорд. В результате такой серной "осады" атом молибдена находится в очень сильной степени окисления +6, а дополнительный атом серы окислен до степени -2.

Когда вышеупомянутые два электрона героически допрыгивают по состоящим из железосерных кластеров проводам до атома молибдена, он восстанавливается до состояния +4, и одна из связей атома серы с ним при этом рвется, что позволяет ему присоединить на освободившуюся валентность один из свободных протонов, содержащихся в воде. Но такое возбужденное состояние активного центра неустойчиво, так как обладает достаточно большой свободной энергией, и как только в него по специальному каналу заходит молекула углекислого газа, он тут же радостно спихивает протон и два электрона на CO₂, превращая его, таким образом, в формиат (HCO₂^-), а сам возвращается в исходное состояние.

Схема восстановления углекислого газа до формиата. Не участвующие непосредственно в реакции части пираноптерина показаны схематично. Взято с сайта Journal of the American Chemical Society

Но приключения самого формиата при этом только начинаются! Выйдя из активного центра формиатдегидрогеназы теперь уже по другому (гидрофобному) каналу он практически сразу же попадает в приемный канал другого фермента - формиат-тетрагидрофолат лигазы. В ней формиат сначала активируется с помощью ATP путем пришивания к нему фосфатной группы PО₄ (один кислород формиата при этом уходит в воду), а потом за счет энергии фосфоангидридной связи то, что от него осталось, то есть, формил (HCO^-), прикрепляется к десятому атому молекулы тетрагидрофолата (ТГФ), замещая на нем водород. ТГФ, кстати, тоже синтезируется на основе уже знакомого нам птерина. Надо сказать, что логика нумерации атомов в молекуле ТГФ достаточно нетривиальная, но для нас сейчас важны лишь два ключевых атома азота - в уже вышеупомянутой позиции номер 10, который на рисунке ниже показан с прикрепленным к нему атомом водорода, изображенным зеленым цветом, и номер 5, который является ближайшим к 10-й позиции азотом. Полученную в результате описанной реакции молекулу называют, соответственно, 10-формил-ТГФ.

ТГФ с прикрепленным к нему в 10-й позиции формилом (показан красным), то есть, 10-формил-ТГФ. Уходящий атом водорода, который был замещен формилом, показан зеленым цветом. Адаптировано их Вики.

На следующем этапе ТГФ покидает формиат-тетрагидрофолат лигазу и дрейфует к входному отверстию следующего фермента рассматриваемого длинного конвейера - Метенил-ТГФ-циклогидролазе (протеин FolD). Как понятно из названия, данный фермент что-то зацикливает. И действительно, после того, как он отработал, образуется как бы замкнутый цикл между атомом углерода, оставшимся от CO₂ (обозначен на рисунке ниже красным цветом) и двумя атомами азота. Как же это ему удается? После того, как ТГФ птериновой головой вперед c "грузом" заходит в каталитический центр указанного фермента, от него отщепляется последний оставшийся атом кислорода, который после этого сразу захватывает два протона и превращается в молекулу воды. Она теперь там только мешает, поэтому тут же выталкивается из каталитического центра, а оставшийся атом углерода с одним атомом водорода оказывается "пришвартован" валентными связями сразу к двум атомам азота ТГФ, находящимся в 5-й и 10-й позициях.

Обсуждаемый 5,10-метенил-ТГФ (метеинил уверенно закреплен на ТГФ с помощью двух атомов азота). Адаптировано из Вики.

После завершения описанной реакции получившийся в итоге 5,10-метенил-ТГФ меняет свою ориентацию в каталитическом кармане и немного сдвигается еще глубже в него. Это, в свою очередь, приводит к изменению конформации всего фермента FolD - "дверь", через которую вышла вода закрывается, так как для следующей реакции нужны строго гидрофобные условия, и, в то же время, открывается карман для доступа восстановленной формы молекулы NAD, которая необходима для второй реакции, осуществляемой данным ферментом.

Кофермент NAD (Nicotinamide Adenine Dinucleotide). Взято из Вики

Кофермент NAD широко используется живыми организмами в окислительно-восстановительных реакциях и может переносить один протон и два электрона. Окисленная форма данного кофермента обозначается как NAD⁺, а восстановленная, как NADH. После того, как молекула NADH оказалась внутри FolD, стенки туннеля, через который вошла молекула ТГФ, "заряженная" метенилом, ощутимо сжимаются. Так как они насыщены положительно заряженными аминокислотами, а хвост ТГФ, содержащий молекулы аминокислоты глутамата, заряжен отрицательно, за счет электростатических сил кофермент надежно блокируется в каталитическом кармане, обеспечивая успешное прохождение второй реакции.

В ней NADH отдает один протон и два электрона и за счет этого метенил (-CH) на ТГФ восстанавливается до метилена (-CH₂). После окончания данной реакции FolD в очередной раз меняет конформацию, и в результате отработанный NAD+, как гильза от патрона, отстреливается из кармана, а стенки входного туннеля для ТГФ ощутимо расширяются, электростатическое притяжение его хвоста к ним ослабевает, и продукт реакции, следуя поговорке - "сделал дело - гуляй смело", наконец, покидает фермент.

Теперь путь ТГФ с полезным грузом в виде метилена лежит к следующему молекулярному комплексу - метилен-ТГФ редуктазе (МТГФР). Как понятно из названия, он осуществляет следующий шаг окисления того, что осталось от бывшей молекулы CO₂ - восстановление метилена до метильной группы -CH₃. В состав рассматриваемого комплекса входит широко распространенный в живых системах кофермент FAD.

Кофермент FAD (Flavin Adenine Dinucleotide). Взято из Вики

Физически он расположен как бы на самом дне имеющего форму бочонка активного центра фермента. FAD, в отличии от NAD, может принимать и отдавать сразу два протона и два электрона. В той ситуации, когда он разряжен, в активный центр белка может зайти только молекула NADH. И как только это случается, два электрона и протон сразу перескакивают на FAD. Еще один не достающий для полного комплекта протон забирается по специальному каналу прямо из воды.

Кстати, лирическое отступление. Обратите внимание, насколько схожа общая структура двух важнейших коферментов NAD и FAD. В обоих случаях это классический нуклеотид AMP соединенный с напоминающей нестандартный нуклеотид частью - неканоническое нуклеиновое основание, рибоза и фосфат (в FAD рибоза представлена не в закольцованной, а в линейной форме, но сути дела это не меняет). Видимо, это не случайность а еще один намек на возможность существования условного мира коферментов еще до мира РНК.

Но вернемся к дальнейшей судьбе метилена на ТГФ. Отдав два электрона и протон на FAD молекула NADH превращается в NAD+, сразу теряет сродство к каталитическому центру и выталкивается из него наружу в цитоплазму. В свою очередь, "заряженный" FAD (обычно обозначается как FADH₂) опять меняет конформацию фермента, теперь в его каталитический карман может зайти только "заряженный" ТГФ, то есть 5,10-метилен-ТГФ, другими словами, все готово к следующему этапу восстановления бывшей молекулы углекислого газа, на этот раз, до метила.

Как только ТГФ заходит в каталитический центр фермента, он сразу фиксируется в нем в наиболее благоприятном для прохождения реакции положении, а два электрона и один протон переходят с FADH₂ на метилен (второй протон при этом по специальному каналу выталкивается в цитоплазму). Это, в свою очередь, приводит к разрыву связи метилена с 10-м атомом азота ТГФ и его восстановлению до метильной группы CH₃. Она остается привязанной лишь к одному (5-му) атому азота ТГФ и вместе с ним выходит из каталитического кармана наружу.

ТГФ с прикрепленной к нему метильной группой после выхода из комплекса МТГФР

Нужно отметить, что описанный выше механизм восстановления метилена используется лишь частью ацетогенов. Некоторые из них практикуют более сложный его вариант, который позволяет клетке одновременно с синтезом метильной группы дополнительно запасать и свободную энергию. Это возможно потому, что рассматриваемая реакция является экзотермической, то есть, идет с выделением, а не поглощением энергии.

В этом более сложном варианте используются сразу две "заряженные" молекулы FAD, а в процессе их окисления параллельно восстанавливаются небольшие гидрофильные белки, так называемые ферредоксины. Внутри они содержат уже упомянутые выше железосерные кластеры, например, 4Fe-4S представляющие собой, по сути, как бы захваченные клеткой элементарные фрагменты кристаллической решетки широко распространенного в земных породах минерала пирит. Ферредоксины могут при определенных условиях принимать и отдавать ровно один электрон переходя, тем самым, из окисленной в восстановленную форму и, соответственно, наоборот. Восстановленные ферредоксины впоследствии используются, в том числе, для выталкивания из цитоплазмы клетки протонов или ионов натрия поддерживая, тем самым, упомянутый выше мембранный потенциал.

Далее путь ТГФ лежит к следующему ферменту конвейера - AcsE, но об этом и многом другом речь пойдет уже в следующей части.

Бактериальная клетка с точки зрения кибернетики. Биоэнергетика — часть 1