Технология CRISPR/Cas9 произвела революцию в геномном редактировании: в 2020 году за нее вручили Нобелевскую премию, а сегодня FDA уже готовится одобрить первую CRISPR-генную терапию для лечения гемоглобинопатий. Однако основной принцип системы CRISPR остается таким же, как и любого другого редактора, будь то мегануклеазы, ZFN или TALEN, — сделать разрыв в интересующем участке и дальше надеяться на естественную систему репарации клетки. Но что, если разрыв будет внесен не только там, где задумано? Так может получиться и нежелательная мутация!

Действительно, основной проблемой технологии остается офф-таргет (off-target) активность, то есть внесение изменений в последовательностях, которые похожи на мишень направляющей РНК, но ею не являются. На фоне широкого распространения метода определение нецелевой активности «молекулярных ножниц» имеет первостепенное значение. Сегодня подробнее обсудим способы детекции побочных эффектов редактирования генома и поближе познакомимся с методом DISCOVER-Seq+!

Предыстория

После появления в 2013 году технологии редактирования ДНК CRISPR/Cas9 было предложено много способов детекции побочной активности, однако они либо предсказывали офф-таргеты чисто теоретически на компьютере, либо работали исключительно с очищенной ДНК или с далекими от реальных организмов бессмертными клеточными линиями in vitro. Между тем поведение нуклеазы Cas9 значительно варьирует в различных клеточных типах и зависит от эпигенетического статуса: состояния хроматина и архитектуры ядра, которые могут препятствовать связыванию белков с ДНК. Поэтому желательны эксперименты с естественными системами: первичными клеточными культурами или животными моделями.

В 2019 году в Science вышло сразу 3 статьи, где предлагались методы детекции офф-таргетов in vivo. В первом случае ученые брали мышиные эмбрионы на двухклеточной стадии. В один бластомер они вносили редактор оснований, а в другой — нет. Потом оба генома секвенировались и сравнивались. В другой работе исследователи секвенировали геном риса после внесения системы CRISPR. В обоих случаях редактирование приводило к росту числа «снипов» по всему геному.

Наконец, третий метод был более универсальным и получил название Discover-seq (Discovery of in situ Cas off-targets and verification by sequencing). В чем его суть? Сначала в клетки вносится генетическая конструкция, экспрессирующая CRISPR-систему. Далее направляемая гидовой РНК нуклеаза Cas9 делает двухцепочечные разрывы (DSB). В эти сайты рекрутируется фактор репарации ДНК под названием MRE11. Вокруг него как раз вращается вся идея метода. MRE11 маркирует своим присутствием любые места разрыва нуклеотидной цепи: как сайты-мишени, так и офф-таргеты.

Дальше — дело техники. Чтобы выделить интересующие последовательности, где сидит белок MRE11, используется метод иммунопреципитации хроматина с последующим секвенированием (ChIP-seq). Экспериментаторы формальдегидом сшивают MRE11 с ДНК, потом режут ее на кусочки и далее с помощью специфических антител к белку-починщику выделяют ДНК-белковые комплексы. Затем кросс-сшивки MRE11 с ДНК удаляют, а нуклеотидные последовательности секвенируют и картируют риды на геном. Пики (участки с большим покрытием) на геномном профиле ChIP-seq как раз содержат сайты связывания MRE11 и указывают на следы целевой и нецелевой активности!

Несмотря на преимущества перед другими техниками, чувствительность Discover-seq оказалась недостаточно высокой, поскольку редактирование Cas9 в разных местах происходит несинхронно. MRE11 находится на ДНК только в момент активной репарации и может уходить с каких-то участков. Из-за этого часть сайтов нецелевой активности Cas9 попросту упускается из виду. Что же делать?

Большой плюс

6 апреля 2023 года в Nature Methods вышла публикация, где была предложена обновленная версия метода, названная DISCOVER-seq+. Чтобы повысить чувствительность, ученые решили добавить к стандартному протоколу Discover-seq ингибиторы репарации ДНК! Молекулярные биологи предположили, что если фармакологически притормозить процесс «залечивания» двухцепочечных разрывов, то MRE11 будет вынужден долго сохраняться на неотрепарированных участках, что должно значительно облегчить обнаружение нецелевых мишеней с помощью ChIP-seq.

Ингибирование репарации повышает чувствительность, что видно при сравнении профилей Chip-Seq. Источник

Ученые доставили Cas9 с направляющей РНК, нацеленной на сайт 3 гена VEGFA, в клетки линии HEK293T. Сайт VEGFA (фактора роста эндотелия сосудов A) был выбран неслучайно: он ранее уже использовался в исследованиях по идентификации офф-таргет эффектов. Далее ученые подвергли клетки воздействию 5 ингибиторов разных мишеней компонентов репарации ДНК, чтобы выбрать оптимальную молекулу. В итоге они остановились на низкомолекулярном соединении Ku-60648, обладающем хорошей биодоступностью и способностью проникать в ткани. Молекула Ku-60648 эффективно блокировала ДНК-зависимую протеинкиназу (DNA-PKc), которая требуется для репарации путем негомологичного соединения концов (NHEJ).

Схема DISCOVER-Seq+ и его приложения. Источник

Добавление ингибитора значительно увеличивало обогащение MRE11 во всех обнаруженных сайтах‑мишенях и офф‑таргетах. Благодаря этому пики на профиле Chip‑Seq стали ярче, и их стало больше. Молекулярные биологи оценили DISCOVER‑Seq+ в трех приложениях: редактирование полученных от пациентов ИПСК, первичных Т‑лимфоцитов для иммунотерапии рака и, наконец, лабораторных мышей. Везде технология показала хорошие результаты: DISCOVER‑Seq+ позволил обнаружить в пять раз больше нецелевых участков, чем его предшественник!

Таким образом, DISCOVER‑Seq+ на сегодняшний день можно назвать самым чувствительным методом обнаружения побочной активности CRISPR/Cas9. Советуем всем генным инженерам взять его на заметку!

Discover-Seq+