Анализ скорости молекулярных микромоторов для диагностики ВИЧ

Вирус иммунодефицита человека или просто ВИЧ — чума XX века. Довольно громкий титул, но он не преувеличен. Данное заболевание унесло миллионы жизней. И с каждым годом число жертв этого коварного недуга растет, как и число исследований, нацеленных на лечение и диагностику ВИЧ. Любое заболевание, и ВИЧ не исключение, проще всего поддается лечению на ранних этапах развития. Но для этого необходим способ опознать его как можно раньше, еще до того, как начнут проявляться первые симптомы. Когда вы, скажем, порезали палец, вы видите порез, то есть вы четко знаете что лечить. ВИЧ же может жить в теле человека не проявляя себя, то есть бессимптомно, довольно долго. Сегодня мы с вами рассмотрим новое изобретение, способное быстро и достаточно точно определить наличие вируса иммунодефицита посредством небольшого устройства, подключаемого к смартфону. Как работает сие новшество, насколько точны его результаты и что планируют исследователи в будущем? На эти и другие вопросы мы будем искать ответы в докладе исследовательской группы.

Теоретическая основа

Говорить о болезнях неприятно, но необходимо. Чем больше мы о них знаем, тем лучше можем оградить себя и своих близких от их воздействия.



ВИЧ — вирус иммунодефицита человека впервые показал свою жуткую гримасу еще в начале 80-ых годов прошлого века. Тогда никто еще не знал что это, а сам вирус не имел даже названия. Дальнейшие исследования показали, что ВИЧ является ретровирусом, который поражает клетки иммунной системы организма человека, одной из самых важных систем. Следствием работы вируса становится подавление иммунной защиты и развитие СПИД — синдрома приобретенного иммунного дефицита. В таком состоянии организм остается беззащитен, и любая, даже самая легкая, инфекция (а также раковые клетки) могут разительно на него воздействовать. По сути ВИЧ уничтожает нашу оборону и враги в лице инфекций спокойно захватывают организм.

ВИЧ обладает контактным механизмом передачи. Заражение может произойти при контакте с кровью, спермой, грудным молоком, предсеменной жидкостью или секретом влагалища. Другими словами, незащищенный половой акт, зараженные медицинские инструменты, даже не дезинфицированные иглы в тату-салонах являются отличным способом распространения для вируса. В период становления ВИЧ, когда паника среди населения распространялась быстрее достоверной информации о том, что есть ВИЧ и как он распространяется, бытовало мнение что заразиться можно от простого рукопожатия. Это миф, ибо вирус не разносится через простое прикосновение с инфицированным человеком. Однако такой вариант заражения также возможно, но только в случае открытых ран на руках инфицированного и возможной жертвы заражения. Я уже не говорю о том, что некоторые считали комаров переносчиками ВИЧ (комар пьет кровь больного и, укусив здорового человека, может его заразить) это тоже миф.


Распространенность ВИЧ в мире по данным Всемирной организации здоровья (2017 год).

Детально описывать вирус и последствия его развития в организме я не стану, ибо мы собрались обсудить не столько сам вирус, сколько новый метод его диагностики. Но стоит заметить, что ВИЧ — терпеливый вирус, способный мутировать в теле зараженного с течением времени, что делает его еще более устойчивым к различным методам сдерживания или лечения. Это еще одна причина почему его необходимо обнаружить как можно раньше. Чем больше у вируса времени, тем он сильнее, и тем слабее зараженный человек.

Из чего состоит устройство?

Ученые, вовлеченные в данном исследовании, говорят о том, что одной из самых серьезных проблем и преград в ранней диагностике ВИЧ, как и других болезней, в мире является нехватка соответствующих условий: лабораторий, персонала, медицинских средств. Именно потому они и решили создать устройство, способное максимально точно указать есть ли вирус в организме или нет. Уровень сахара в крови уже давно можно проверить с помощью переносимых компактных устройств (глюкометров), то есть без необходимости посещать лабораторию и ждать результатов тестов по несколько дней. Стоимость таких устройств достаточно низка, что также сопутствует их распространению.

Устройство, с которым мы сегодня будем знакомиться, коротко можно описать так: мобильный анализатор для молекулярного определения ВИЧ-1 на базе петлевой изотермической амплификации (LAMP) и наномоторов (CALM). А теперь по-порядку.

Наномоторы

Наномоторами (еще их называют микромоторы) именуются микроскопические молекулярные устройства, которые способны преобразовывать энергию в движении. Если их поместить в определенный химический раствор, они начинают самостоятельно передвигаться по определенному маршруту, что можно использовать и в диагностике, и даже в энергообеспечении нано-технологичных устройств.


Схема формирования микромоторов для ВИЧ-тестера.

Микромоторы представляют собой сферы из полистирола, покрытые наночастицами Pt (платины) с плотностью 1.04 г/см. Далее были использованы еще и наночастицы Au (золота) для модификации микромоторов ДНК-зондами (на схеме выше они представлены в виде красных «щупалец»).

ПЭМ (просвечивающий электронный микроскоп) показал, что наночастицы платины и золота, использованные в покрытии микромоторов, были сферической формы, а их диаметр составлял 57.721 ± 5.181 нм (Pt) и 3.43 ± 1.336 нм (Au).


Выше представлены снимки ПЭМ, фото колб с заготовленными наночастицами и результаты оптической спектроскопии.

Необходимо было проверить насколько эффективно ДНК-зонд полностью сформированного микромотора может захватывать молекулы ДНК. Для этого была применена техника электрофореза в агарозовом* (C₁₂H₁₈O₉) геле.

Агароза* — линейный полисахарид, сформированный последовательностью остатков β-D-галактопиранозы и 3,6-ангидридо-α-L-галактопиранозы, объединенных связью 1→4. Получается из агара.

Данная методика позволила подтвердить, что микромоторы имеют ДНК-зонды на своей поверхности, поскольку те смогли присоединить искусственную молекулу ДНК примерно на 180 bp (спаренные основания), что для подобного (искусственного) образца является отличным результатом (изображение слева). Степень эффективности захвата составила во время первых тестов примерно 30%, что подтверждается флуориметрией (изображение слева).


Тут мы видим как двигаются микромоторы в растворе с разной концентрацией H₂O₂ (0, 5, 10 и 15%).

Также необходимо было проверить самую важную особенность микромоторов — движение. Для этого использовался раствор с и без H₂O₂ (сравнение траекторий на изображении d ниже). Когда пероксид водорода отсутствовал, микромоторы вибрировали, что связано с броуновским движением. Когда же в раствор начали вводить H₂O₂, скорость движения микромоторов увеличилась примерно на 0.7 мкм/с на каждый 1% пероксида водорода в растворе.


Измерения скорости движения микромоторов в тестовом растворе.

На графике а показана зависимость скорости движения микромоторов диаметром 6 мкм и концентрации H₂O₂ в растворе. Также (справа) показан снимок микромотора и траектория его движения. Диаграмма b показывает степень стабильности микромоторов при различных температурах в 5% растворе пероксида водорода. Ниже (график и снимок) мы видим как меняется показатель стабильности с течением времени (120 с), а также траекторию движения уже в 15% растворе. Среднеквадратичное смещение с течением времени показано на графиках е: черные точки — раствор без H₂O₂, красные — 5% H₂O₂.

Ниже, на изображении f, мы видим, что не только состояние раствора, где находятся микромоторы, влияет на их поведение, но и сами микромоторы, а точнее их структура, также значительно изменяют его. Мы видим, как микромоторы диаметром 3 мкм без напыления из платины и золота двигаются (синие линии) по сравнению с полноценными испытываемыми микромоторами диаметром 6 мкм (красные линии). Справа от сравнения траекторий представлено сравнение среднеквадратичного смещения микромоторов (3 мкм и 6 мкм в диаметре).

Мобильное устройство

Для визуализации и отслеживания микромоторов (то есть для наблюдения за тем, как происходит диагностика) послужил телефон Motorola XT1575 (ОС Android).


Внешний вид и детали устройства.

Важной составляющей устройства является чип, необходимый для проверки движения микромоторов. Он был изготовлен из полиметилметакрилата (из оргстекла). К нему с помощью 80 мкм слоя клея была прикреплена стеклянная основа с вырезанным лазером «каналом» шириной 2 мм.


Внешний вид чипа и его габариты.

Как видно из снимков выше, чип не является единственной частью устройства. Синий съемный корпус был изготовлен из недорогих материалов на 3D-принтере. Внутри этого корпуса имеются белый светодиод, батарея на 3,3 В, переключатель и недорогие оптические линзы. Также в корпусе есть держатель образцов, позволяющих размещать их между линзами и камерой телефона.

А теперь о софтовой составляющей. Программное обеспечение было создано в Android Studio с использованием библиотек OpenCV 3.1.0. Интерфейс, по словам ученых, был сделан максимально понятным и практичным для пользователей.


Интерфейс ВИЧ-тестера.

Когда образец помещается в устройство, программа записывает видео (30 fps, 320х240 пикселей), на котором видно движение микромоторов, рассчитывает скорость их движения и в течение 1 минуты выдает результат анализа.

Петлевая изотермическая амплификация (LAMP)

Насколько эффективно система микромоторов способна опознавать ВИЧ-1? Ответ на этот вопрос кроется в LAMP реакциях. Для тестирования было подготовлено несколько образцов с различной концентрацией РНК (рибонуклеиновой кислоты) ВИЧ-1. Результат амплификации оценивался электрофорезом в агарозовом геле.


LAMP тестирование.

Результаты электрофореза показали ступенчатое формирование крупных ДНК-ампликон (последовательность ДНК, результат амплификации). Число ампликонов оказалось пропорциональным концентрации РНК ВИЧ-1.

Микромоторы были смешаны с ампликонами РНК ВИЧ-1, дав возможность пройти процессу гибридизации (при температуре 80 °C). Далее полученную «смесь» тестировали в 5% растворе H₂O₂. Когда в системе присутствовали ампликоны РНК ВИЧ-1, скорость движения микромоторов очень сильно снижалась, примерно на 95.26%. Снижение скорости наблюдается даже при незначительной концентрации ампликонов (около 3.394 ± 0.245 нг/мкл).


Демонтсрация движения микромоторов при отсутствии РНК ВИЧ-1.


Демонтсрация движения микромоторов при наличии РНК ВИЧ-1.

Ученым удалось также осуществить восстановление микромоторов и их скорости. Для этого «зараженный» образец с микромоторами и ампликонами инкубировался в течении 30 секунд при температуре 90 °C. Это позволило высвободить ампликоны от ДНК-зондов микромоторов. Далее следовало центрифугирование при 6000 х g в течение 5 минут. Проверка полученного образца в 5% растворе H₂O₂ показала, что скорость микромоторов восстановилась до уровня 75.52% от изначальной, до проведения тестирования с участием ампликонов РНК ВИЧ-1.

Также была проверена реакция системы на другие виды вирусов, передающиеся половым путем: гепатит С и B, герпес, папилломавирус 16 (HPV-16). Ввиду частых случаев параллельного заражения как ВИЧ, так и какими-то из вышеперечисленных вирусов, этот тест имел также большое значение. Результат был удовлетворительный — ДНК-ампликоны формировались только при наличии ВИЧ. То есть наличие других вирусов в тестируемом образце не повлиял на процесс проведения его проверки.

Вывод прост — метод способен определить наличие ВИЧ. Но теперь необходимо провести калибровку, чтобы система могла отличить наличие и отсутствие вируса в образце, ориентируясь на стандартное значение концентрации 1000 частиц/мл. Если концентрация ниже этого показателя, то результат отрицательный (вирус отсутствует), если же концентрация выше — положительный. Для проведения калибровки необходимо было определить какая скорость микромоторов соответствует какой концентрации. Для этого было использовано PBS — натрий-фосфатный буфер (специальный раствор для исследований) и плазма пациентов с и без ВИЧ.

Калибровка проходила с помощью PBS, в котором уровень концентрации синтетических стабилизированных РНК ВИЧ-1 варьировался от 0 до 107.

После проведения калибровки стало ясно, что средняя скорость микромоторов при концентрации ВИЧ 1000 равна 0.705 ± 0.082 мкм/с.


Результаты определения концентрации РНК ВИЧ-1.

Также ученые провели анализ работы системы с использованием ROC-кривой, который показал очень воодушевляющие результаты. Чувствительность* испытываемой системы составила порядка 94.6% при значении ДИ* — 81.8–99.3%, а специфичность* составила 99.1% при ДИ — 80.5–100%.

Чувствительность* — показатель, отражающий долю положительных результатов (в данном случае это вероятность того, что концентрация ВИЧ в образце выше 1000).

Специфичность* — показатель, отражающий долю отрицательных результатов (в данном случае это вероятность того, что концентрация ВИЧ в образце ниже 1000).

ДИ* — доверительный интервал, то есть интервал, охватывающий неизвестный параметр с заданной надежностью.

Диаграмма рассеяния результатов работы системы также показала невероятные результаты. Так, точность определения образца с высокой концентрацией ВИЧ как положительного равно 100%, а точность определения отрицательных образцов — 90%.

Видео-материалы:

Видео, на котором видно как движутся микромоторы при концентрации РНК ВИЧ-1 выше порогового значения (образец положительный).

Видео, на котором видно как движутся микромоторы при концентрации РНК ВИЧ-1 ниже порогового значения (образец отрицателей).

Желающие более детально ознакомится с исследованием могут заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

Ученые, создавшие это удивительное устройство, не отрицаю, что им еще предстоит провести множество тестов, калибровок, усовершенствований. Но они явно на правильном пути. Подобные устройства могут значительно снизить скорость распространения ВИЧ, особенно среди населения в местах, где лаборатории с персоналом и кучей медицинского оборудования попросту отсутствуют.

Да, устройство пока выглядит не очень компактным и факт того, что оно требует применения смартфона может кого-то оттолкнуть. Однако в будущем подобные технологии ранней диагностик ВИЧ будут продолжать совершенствоваться и не только в вопросах эффективности и точности, но и удобства и ценовой доступности.

ВИЧ это чума XX века, как я уже писал в самом начале сего повествования. Но, к сожалению, этот вирус не так далек от титула «чума XXI века». В наше время несколько заболеваний уже претендуют на такой громогласный титул (к примеру, депрессия, диабет и т.д.). И каждое из этих заболеваний требует огромного внимания. И пока нет волшебной пилюли, способной излечить от любого недуга, нам остается лишь совершенствовать имеющиеся методы диагностики, которые дают нам дополнительное время на поиск лечения или сдерживания заболевания. Как говорят — чем раньше мы знаем о проблеме, тем больше у нас шансов решить ее.

Еще одним важным моментом является социальная активность, открытость и обсуждения. Проблема должна обсуждаться, ибо если даже говорить о ней страшно, то как общество намерено с ней бороться?

В любом случае, на этом у меня все. Берегите себя и своих близких.

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас оформив заказ или порекомендовав знакомым, 30% скидка для пользователей Хабра на уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps от $20 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

VPS (KVM) E5-2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps до декабря бесплатно при оплате на срок от полугода, заказать можно тут.

Dell R730xd в 2 раза дешевле? Только у нас 2 х Intel Dodeca-Core Xeon E5-2650v4 128GB DDR4 6x480GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $249 в Нидерландах и США! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?