Главным ограничителем оптической микроскопии долгое время был дифракционный барьер. В силу самой физической природы света объекты на расстоянии менее ~200 нм неразличимы. Можно, конечно, решить вопрос радикально и вместо фотонов воспользоваться пучком электронов. Однако электронная микроскопия требует жесткой пробоподготовки и применима только к неживым образцам. Обойти дифракционный предел позволила флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения — технология, за которую дали Нобелевскую премию по химии в 2014 году.
Сегодня существует множество способов добиться суперразрешения. Один из популярных — локализационная микроскопия одиночных молекул (Single-molecule localization microscopy, SMLM). В ее основе лежит идея контроля концентрации флуорофоров: ученые добиваются того, чтобы в каждый момент времени зажигалась лишь малая толика одиночных излучателей, расположенных на расстоянии больше дифракционного барьера. Дальше — дело техники.
Фиксировать сигнал флуоресценции точечных источников света физики умеют: несмотря на то, что даже один наноразмерный флуорофор будет виден в микроскоп как расплывчатое пятно в 200 нм в диаметре — ведь дифракцию никто не отменял — центр эмиссии и, соответственно, локализацию мишени можно рассчитать математически, аппроксимировав «пятно» гауссовой функцией.
Проведя многочисленные последовательные циклы перевода ограниченного числа молекул флуорофора во флуоресцентное состояние, их детекции и фотообесцвечивания, мы получаем много-много изображений. Далее остается сложить их вместе и получить конечную картинку. Таким образом, эмиттеры, которые находятся на субдифракционном расстоянии, в SMLM становятся разрешимыми за счет разделения не в пространстве, а во времени.
Как раз для временного разделения чаще всего используют фотопереключение. Поэтому необходимо, чтобы флуорофоры, которыми метят исследуемый объект, обладали способностью включаться/выключаться под действием освещения. Здесь широко применяют синтетические флуорофоры-красители (метод STORM) или флуоресцентные белки (метод PALM).
DNA-PAINT
Но бывают еще ДНК-зонды: такую технологию называют DNA-PAINT (DNA points accumulation for imaging in nanoscale topography). В этом методе нужны одноцепочечные молекулы ДНК, которые сшиты с антителами к белку-интереса (docking strand) и ДНК-зонды, комплементарные им и меченные флуорофорами (imager strand). Однако никакого фотопереключения в DNA-PAINT не требуется, поскольку флуоресценция запускается только при гибридизация ДНК-цепочек, которая то возникает, то исчезает в буфере сама собой.
Исследователи маркируют мишень первым олигонуклеотидом ДНК, сшитым со специфическим антителом. Затем добавляют уже флуоресцентно меченные ДНК-зонды. Наблюдается случайное мерцание редких флуорофоров: ученые только фиксируют изображения, как и в любом другом стохастическом методе. Эта изящная, но довольно времязатратная техника была разработана немецкими учеными из Института биохимии Макса Планка под руководством Ральфа Юнгманна в 2014 году.
ДНК-зонды оказались очень удобны для целей мультиплексирования, то есть одновременного изучения сразу нескольких мишеней в образце. Подметод получил имя Exchange-PAINT. По-прежнему достаточен всего один флуорофор: но теперь он пришивается к разным ДНК-зондам, и белки мишени тоже метятся разными олигонуклеотидами. Сначала добавляются зонды для первой мишени, потом происходит промывка, затем все повторяют для второй.
RESI
Сегодня группа биофизиков из лаборатории Юнгманна усовершенствовала свой метод, и теперь он обеспечивает точность локализации в 1–2 Å и субнанометровое разрешение с использованием обычного флуоресцентного микроскопа и стандартных реагентов DNA-PAINT! Сотрудники Юнгаманна разработали так называемый метод RESI — улучшение разрешения за счет последовательной визуализации (resolution enhancement by sequential imaging). Статья вышла 24 мая 2023 года в журнале Nature.
Чтобы понять как работает RESI, нужно сделать ремарку: в SMLM-методах, когда получают множество картинок мерцания флуорофоров в разные моменты времени, локализация конкретной флуоресцирующей молекулы определяется неоднократно. В результате эксперимента формируется целое облако точек от одной мишени. А истинное же положение источника эмиссии рассчитывается с помощью статистики и теории вероятности.
Когда же в образце имеется много копий одной молекулы, особенно расположенных очень близко друг к другу, то облака локализаций могут легко перекрываться, что затрудняет их различение. Именно из-за этого максимальная разрешающая способность микроскопии сверхразрешения ограничена 10-15 нм.
Что делает RESI? Он берет лучшее от DNA- и Exchange-PAINT и вводит дополнительную степень дифференциации. С помощью разных ДНК-зондов физики решили мультиплексировать одну мишень, пометив разными олигонуклеотидами соседние копии одной и той же молекулы. И теперь, когда на картинках получают перекрывающиеся облака локализаций, их можно точно группировать, потому что визуализация происходила последовательно. Такая нехитрая идея позволила различить молекулы на расстоянии менее 1 нм.
Неограниченное разрешение
Ученые продемонстрировали «крутизну» RESI в трех приложениях.
Ядерная пора
Во-первых, ядерный поровый комплекс (NPC). Это классическая мишень в структурной биологии. Путем маркировки нуклеопоринов Nup96 команда Юнгманна смогли определить расстояние между отдельными субъединицами ядерной поры с непревзойденным разрешением (12 нм), подтвердив данные криоэлектронной микроскопии.
Цепи ДНК
Во-вторых, чтобы продемонстрировать всю мощь RESI, ученые воспользовались ДНК-оригами — техникой направленного конструирования объектов из ДНК. Они смастерили структуру из 6 пар (с интервалом 20 нм) docking strand, расстояние между которыми было всего в ОДНУ пару оснований. RESI смог различить две метки на соседних цепях ДНК с точностью 1,2 Å. Прежде это можно было «делать» только с помощью электронной микроскопии!
Антитело и CD
Наконец, специалисты применили RESI для наиболее практически значимых целей: специалисты изучили взаимодействие противоопухолевого моноклонального антитела Ритуксимаб со своим рецептором CD20 в мембране интактных клеток. Клеточные биологи давно пытаются понять, какую форму имеют кластеры CD20: линейную или кольцевую. Группа Юнгманна наблюдала за организацией олигомеров CD20 при связывании с терапевтическими антителами и подтвердила гипотезу о сборке линейных цепочек мембранного рецептора.
Хотя в настоящее время метод работает только с неподвижными клеточными структурами и, следовательно, фиксированными клетками, он имеет огромные перспективы. По мнению создателей, RESI должен проложить мостик между флуоресцентной оптической микроскопией сверхразрешения и криоэлектронной микроскопией и другими методами структурной биологии.
К тому же, для исполнения RESI сгодится любой флуоресцентный микроскоп, что делает его доступным практически для всех исследователей уже сейчас!
