Нейробиологический проект Rybka Project

    Память человека и позвоночных животных до сих пор остается одной из главных загадок нейробиологии. Несмотря на многочисленные исследования, окончательного ответа на вопрос «где в мозгу хранится запоминаемая информация?» до сих пор не найдено.
    Пролить свет на этот вопрос призван и наш проект: изучение молекулярно-биологических механизмов долговременной памяти с помощью рыбки данио-рерио (Danio Rerio) англоязычном обиходе известной как «zebrafish».

    Это популярная лабораторная рыбка, являющаяся стандартным модельным организмом в исследованиях по эмбриологии, стволовым клеткам и др. Геном данио секвенирован, что упрощает её генетическую модификацию.

    Врезка о модельных организмах
    Поскольку основным мотиватором биологических исследований является медицина, можно сказать что «главным» является единственный вид HomoSapiens, а все остальные являются «моделями», на которых можно ставить эксперименты. Поэтому такие организмы называются модельными. Диапазон их чрезвычайно широк: от бактерии до шимпанзе. Среди стандартных модельных организмов присутствуют кишечная палочка E. Coli, хлебные дрожжи, червячок-нематода C. Elegans, мушка-дрозофила, рыбка данио, лягушка, аксолотль, мышь и крыса, курица, 2 вида макак, шимпанзе. Каждый организм хорош для определённых типов экспериментов: так например бактерии быстро эволюционируют, поколения могут сменяться за минуты, аксолотль используется для экспериментов по регенерации, а высшие приматы — для изучения когнитивных способностей, возникновения речи, интеллекта и пр. Многие модельные организмы имеют чистые линии — выведенные путем близкородственного скрещивания. Такие организмы называются линейными, любые 2 особи из одной линии имеют практически идентичные геномы.
    Наш герой — данио-рерио, популярная аквариумная рыбка из семейства Карпообразные, известен также как брахиданио рерио или зебрафиш (zebrafish). В дикой природе эта рыбка обитает в бассейне Ганга в Индии и сопредельных странах. Данио может вырасти до 6-7 сантиметров, довольно неприхотлив в аквариумном содержании и легко размножается. Эмбриогенез данио длится 48 часов, после чего формируется личинка, половой зрелости рыбка достигает в 3 месяца. Известно более 10 лабораторных линий данио, его геном расшифрован, рыбка имеет 25 хромосом.

    Рыбка имеет достаточно сложный мозг, чтобы быть способной обучаться и для наличия памяти. Так, например, она может научиться проходить простейшие лабиринты, плыть за кормом в определённое место по звуку колокольчика, и некоторым другим несложным «трюкам».
    С другой стороны рыбка – это рыбка, т.е. водное животное с внешним оплодотворением, что очень сильно облегчает её генетическую трансформацию и выращивание. Действительно, не требуется выделять яйцеклетки, оплодотворять их in vitro, а затем внедрять и модифицированную зиготу в матку, как это бывает у млекопитающих.

    Рисунок 1. Даниорерио обычный («дикий»), вверху и его малёк, внизу

    Следующее важное качество рыбки- тело ее способно пропускать свет. У «диких» форм данио (рис. 1 ) прозрачны только мальки, однако существует специальная порода под названием Каспер, не имеющая пигментов (рис. 2).

    Рисунок 2. Данио породы Каспер

    Касперы почти прозрачны даже во взрослом возрасте, что позволяет неинвазивно заглядывать к ним внутрь, то есть изучать то, что происходит в них внутри с помощью обычной камеры и без операции, в процессе их обычной жизнедятельности. В эксперименте, мы будем использовать технологию светящегося белка, что позволит подсветить интересующие нас процессы в рыбе, подробнее об этом ниже.
    Вот почему мы выбрали данио для нейробиологического проекта, который так и называется Rybka Project (http://rybka.org.ua).
    Наш проект направлен на изучения механизмов долговременной памяти, ее консолидации (перехода кратковременной памяти в долговременную), а также синаптической пластичности (см. ссылка). Согласно литературе [1-4] в процессе формирования памяти участвует несколько десятков белков.
    Наша задача — исследовать активность некоторых из них в реальных условиях, динамику их синтеза во времени и пространстве (распределение по областям и фрагментам мозга). Для этой цели мы собираемся использовать такие генетические модификации (трансфекции) рыбки, при которых с промотором интересующего нас гена (который кодирует нужный белок) соединяется участок ДНК, кодирующий GFP ( green fluorescen tprotein, зелёный флуоресцентный белок).
    Таким образом мы делаем так что экспрессия нашего целевого гена влечет также синтез флуоресцентного белка, который светится при освещении ультрафиолетом. Это делает видимыми мозговые процессы, происходящие с участием этого гена.
    Такая методика в последнее десятилетия стала довольно популярной, в том числе и в экспериментах с рыбкой [5]. На технологии светящегося белка основан также эксперимент, близкий к нашему, который описан здесь (http://habrahabr.ru/sandbox/57219/).

    Рисунок 3. Zif268 связывается с ДНК.

    Для примера рассмотрим один из «белков памяти», которые фигурируют в нашем проекте. Он называется zif268 (рис. 3) и является металлопротеином, т.к. «готовая» белковая молекула включает в себя два атома цинка. Кроме того, он является транскрипционным фактором и способен взаимодействовать с ДНК.
    После того как трансгенные рыбки будут выращены, нашей задачей является наблюдение за ними с помощью камер высокого разрешения – таких, которые позволят в подробностях разглядеть их мозг, зафиксировав интенсивность свечения зелёного белка в различных его частях.
    При этом рыбки будут решать различные задачи на обучение и запоминание такие как прохождение несложных лабиринтов, выработка условного поведения (напр. приплывание за кормом по колокольчику), освоение незнакомой обстановки и др.
    Мы сможем увидеть, в каких частях и структурах мозга образуется тот или иной белок, отследить динамику его появления по отношению к сеансу обучения, связь различных белков с типом образов в памяти, и другие интересные факты.
    Мы надеемся, что такие эксперименты позволят подойти ближе к раскрытию секретов памяти, понять механизмы длительного хранения информации в мозгу, а также дать ключ к разработке более реалистичных моделей биологических нейросистем. Помимо основной задачи проекта также можно получить и другие, смежные результаты: от изучения экспрессии других групп белков у позвоночных до «производства» различных вариаций светящихся рыбок для аквариумов. В данный момент проект находится на начальной стадии, идет теоретический анализ, дизайн протоколов трансфекции (генетической модификации), методов регистрации и анализа данных. Планируется закупка рыбок, оборудования и реактивов. Ведётся также поиск средств для проекта, ведь в данный момент он не имеет какой-либо финансовой поддержки. Возможна подача заявки на грант, либо же краудфандинг.
    Есть успешный опыт краудфандинга для проекта «I am a little mouse and I want to live longer!», многие люди из команды которого также участвуют в Rybka Project.

    Мы планируем публиковать новости о развитии проекта, и результаты исследований – когда они появятся. Приветствуются комментарии и предложения от всех, кому это интересно.

    Литература


    1. Garcia-Osta A. and Alberini C.M. (2009) Amyloid beta mediates memory formation. Learning and Memory. 16:267-272.
    2. Alberini C.M. (2009) Transcription Factors in Long-Term Memory and Synaptic Plasticity. Physiol Rev. 89:121-45.
    3. Chen DY, Stern SA, Garcia-Osta A, Saunier-Rebori B, Pollonini G, Bambah-Mukku D, Blitzer RD, Alberini CM. (2011) A critical role for IGF-II in memory consolidation and enhancement. Nature 469:491-497.
    4. Milekic, Maria H., and Cristina M. Alberini. «Temporally graded requirement for protein synthesis following memory reactivation.» Neuron 36.3 (2002): 521-525.
    5. Kimberly Dooley, Leonard I Zon, Zebrafish: a model system for the study of human disease, Current Opinion in Genetics & Development, Volume 10, Issue 3, 1 June 2000, Pages 252-256, ISSN 0959-437X.

    Share post
    AdBlock has stolen the banner, but banners are not teeth — they will be back

    More
    Ads

    Comments 11

      +5
      Мои благодарности за познавательную статью.

      После фразы
      окончательного ответа на вопрос «где в
      мозгу хранится запоминаемая информация?» до сих пор не найдено.

      стоило бы дать ссылку, например, на отрывок или полную книгу Маркова чтобы читатели могли ознакомиться в каком состоянии находятся сейчас научные преставления на этот счёт (если правильно помню, краткий ответ – память распределена по всему мозгу).
        +4
        Спасибо Вам за упоминание Маркова. Сам прочитал все его книги про эволюцию. Ответ, что память распределена по всему мозгу неинформативен, хочется понять законы этого распределения, и на какой «материальный носитель» записывается память.
          +1
          Ответ, что память распределена по всему мозгу неинформативен, хочется понять законы этого распределения

          Да, тут больше подошёл бы другой ответ (но тоже обобщающий). Что касается материального носителя, то вроде как ответ по первой моей ссылке такой:
          У млекопитающих ключевую роль в обучении и формировании долговременных воспоминаний играет непрерывное отращивание дендритами (короткими, разветвленными «входными» отростками нейронов) новых маленьких отросточков — дендритных шипиков. Шипики образуют контакты (синапсы) с другими нейронами и служат для приема сигналов. Наряду с отращиванием новых шипиков постоянно происходит исчезновение старых (это, очевидно, приводит к полному или частичному забыванию результатов прежнего обучения). Таким образом, нейрон может «подключаться» к тем или иным своим соседям и отсоединяться от них, усиливать и ослаблять силу контакта с ними (то есть придавать больший или меньший «вес» получаемым от них импульсам).

          Про рыб ничего не говорится, да и как происходит возникновение этих шипиков — тоже вроде не ясно из того отрывка:
          Нейробиологи… использовали в своих опытах генно-модифицированных мышей, у которых некоторые нейроны коры головного мозга (а именно пирамидальные нейроны слоя V неокортекса, см.: Pyramidal neuron) производят желтый флуоресцирующий белок. Это позволяет наблюдать за ростом и отмиранием дендритных шипиков прямо у живых мышей, сквозь череп, при помощи двухфотонного лазерного микроскопа.

          Так что удачи вам!
        +3
        А можно вопрос автору и всем, почти в тему. Интеллект животного прямо пропорционален абсолютной массе мозга или массе относительно массы остального тела? Если первое, то киты, наверное, должны быть на несколько порядков умнее homo sapiens? Или нейроны/клетки мозга крупных животных тоже крупнее и их количество сравнимо с количеством в мозгу животных помельче?
          +2
          Четкой корреляции нет, по идее. Но сравнивать относительный вес правильнее, в таком случае сразу после человека идут дельфины, что логично.
          Еще есть такой момент, что мозг отвечает за органы чувств, ориентацию в пространстве и много чего еще. Например у человека в процессе эволюции ухудшилось обоняние, соответственно уменьшилась доля мозга за него отвечающая, что благотворно сказалось на умственных способностях.
          Кстати, среди гениальных ученых встречались люди с маленьким мозгом и наоборот.
            +3
            Интеллект зависит от количества связей между нервными клетками. Чем больше связей, тем больше возможностей.
              +2
              Точно ответить на этот вопрос (о количестве нейронов) я не могу. Известно, что основное значение имеет т.н. «коэффициент энцефализации» EQ= m/(0.055*M^0.74), где M и m масса тела и мозга соответственно (в граммах).

              Очевидно, что синий кит не умнее дельфина и тем более человека, корова не умнее крысы, и т.д.

              Думаю, есть минимальный размер животного (где-то порядка крысы), все кто мельче- заведомо «поглупее».
              Есть данные что мозг птиц эффективнее чем у млекопитающих, напр. попугай жако почти столь же разумен как шимпанзе, он может иметь лексикон из 800 слов, осознанно их использовать и поддерживать осмысленную беседу (см. историю попугая Алекса).
              +1
              >>> Это делает видимыми мозговые процессы, происходящие с участием этого гена.
              Я правильно понимаю, что для изучения N генов нужно повторить эксперимент полностью заново N раз, при этом стараясь в точности воспроизвести все тонкости, чтобы добиться сходных процессов обучения?
                0
                Да, это так. В прочем, сейчас мы рассматриваем возможности подсвечивать одновременно 2-3 белка с помощью разноцветных светящихся «вставок». Если получится- будет красиво и эффективно.
                +1
                Для этой цели мы собираемся использовать такие генетические модификации (трансфекции) рыбки, при которых с промотором интересующего нас гена (который кодирует нужный белок) соединяется участок ДНК, кодирующий GFP ( green fluorescen tprotein, зелёный флуоресцентный белок).

                А насколько сложно/дорого проделать данную операцию? Какие компании имеют доступ к подобным технологиям? Принимают ли они заказы? :)
                  +2
                  Многие методы трансфекции, такие как электропорация, липидная трансфекция (липофектамин), микроинъекция, заражение ретровирусом (вирусная трансдукция) относительно просты и недороги, сейчас мы осваиваем эти технологии.

                  Основная сложность — синтез так называемого вектора, т.е. вируса, ретротранспозона, или плазмиды, которые способны обеспечить встраивание трансгенной ДНК в нужную точку ядерного генома клетки.

                  Такие векторы можно заказать во многих компаниях США и Китая, ориентировочная стоимость одной «порции» (которой хватит на эксперимент с одним белком ) находится в диапазоне от 100 до 1000 долларов.

                Only users with full accounts can post comments. Log in, please.