Да, тут есть еще тонкий момент: химический раствор у ученых в пробирке — это совсем не то, что среда внутри живой клетки. Например, внутри живой клетки фактически нет свободных молекул воды, а в растворе их полно. Поэтому возможна такая ситуация, когда белок в естественных условиях синтезируется в количестве две-три молекулы на всю клетку и в таких условиях он прекрасно сворачивается и работает. Однако если мы запустим суперпродукцию белка (нужный белок будет составлять 5-50% от всех белков клетки по массе), то белок не будет успевать сворачиваться, плюс ему будет плохо в условиях раствора в пробирке и он обидится и выпадет в осадок. Справедливости ради стоит отметить, что большинство белков счастливы и растворимы и после суперпродукции, и после переноса их из клетки в химический раствор. Как-то так. Уффф…
В принципе, все правильно.
В практическом плане это выглядит так — белок же не берется сам по себе с потолка, его продуцируют в бактериях или культуре эукариотических клеток, в которые засунут ген нужного белка так, чтобы бактерия или клетка вырабатывала его в больших количествах (по-научному — ген под контролем сильного промотора). Соответственно, в какой-то момент у нас есть несколько грамм бактерий, собранных после выращивания в паре литров среды. Мы эти бактерии суспендируем в некотором растворе и разрушаем их клеточную стенку и мембраны ультразвуком или специальным прессом (грубо говоря, клетки лопаются). В результате имеем растворимую фракцию белков и прочего клеточного содержимого плюс «осколки» клеток, которые нерастворимы. Растворимое отделяется от нерастворимого центрифугированием, а потом смотришь — есть ли твой белок в растворе или он находится вместе с осколками клеток в нерастворимом осадке. Обычно считается, что если белок не растворим, значит по какой-то причине он не смог свернуться, хотя реально никто не знает, в чем там точно дело. Как-то так. Причем хитро перебирая компоненты раствора иногда удается растворить нерастворимый белок. Но редко :(
Для проведения экспериментов, как Вы понимаете, нужен растворимый, функционально активный белок…
Существуют и тепловая, и холодовая денатурация (разрушение структуры) белка, они возникают за счет разных эффектов. Если на пальцах, то тепловая денатурация происходит из-за разрушения водородных связей при повышении температуры, подвижность возрастает и белок разворачивается. Обычно белки денатурируют в диапазоне ~50-70 градусов Цельсия, так называемые термостабильные белки выдерживают и более высокие температуры, до 90-110 градусов. Холодовая денатурация — за счет изменения свойств воды при понижении температуры, гидрофобный эффект ослабляется при низких температурах и может привести к разворачиванию белка. Для большинства белков температура холодовой денатурации ниже 0 по Цельсию, то есть белок еще не успевает денатурировать, а раствор уже замерзает. Для некоторых же белков холодовая денатурация наблюдалась экспериментально. Подробности про сворачивание и температуру здесь: phys.protres.ru/lectures/protein_physics/l16.html
Первый вопрос — в первом приближении, да, именно так, во всяком случае это скоррелированные параметры. Если белок растворим и не выпадает в осадок — это хороший знак, он свидетельствует, что белок скорее свернут, чем нет (но не гарантирует, особенно для больших белков — часть белка может свернуться, а часть — нет). Если белок нерастворим — скорее всего, не смог свернуться. Тут все дело в гидрофобных остатках — в свернутом белке они «спрятаны» внутри глобулы, где формируют гидрофобное ядро, а снаружи глобулы — гидрофильные и заряженные группы, обеспечивающие растворимость (в общем случае). Если белок не смог свернуться, то гидрофобные остатки могут торчать наружу, «слипаться» с торчащими наружу аналогичными остатками других молекул белка, вызывая массивную аггрегацию и выпадение в осадок. Как-то так, но из любого правила могут быть исключения.
Второй вопрос — раньше именно так и считалось, однако сейчас потихоньку приходит понимание, что есть «intrinsically disordered proteins» — разупорядоченные белки, не имеющие выраженной трехмерной структуры и при этом выполняющие свои функции. Такие белки не могут быть ферментами, выполняющими катализ (для катализа нужна четкая структура), но они часто участвуют в белок-белковых взаимодействиях и регуляции клеточных процессов. Дело в том, что для связывания с другим белком структура не очень важна, так как структурированный белок может распознавать и связывать кусок несвернутого белка-партнера (BRCT domain, например). В свою очередь, на несвернутом белке могут быть сайты распознавания для нескольких разных структурированных белков и он может служить «затравкой» для образования биологически важного комплекса из нескольких белков. Связывание структурированных белков с неструктурированным, в свою очередь, может регулироваться белками-регуляторами за счет фофсорилирования неструктурированного белка, например.
Длина цепи – от 70 до более чем 1000 мономеров (аминокислотных остатков), средняя длина для высших организмов – примерно 500-600 аминокислотных остатков, для бактерий эта величина будет меньше, скорее 300-400 остатков.
Каждая аминокислота состоит из от 10 до почти 30 атомов, включая атомы водорода. То есть в среднем в белке несколько тысяч атомов, в крупных может быть больше десятка тысяч.
Если же запускать молекулярную динамику, то белок обычно помещают в «коробочку» из воды, так как взаимодействие с водой критично для белка (хотя раньше и в «вакууме» гоняли, но поняли, что это не кошерно). Соответственно, молдинамика в таких случаях еще должна все атомы воды просчитывать.
Знакомые все лица :) Я сам в Пущино кандидатскую делал, только не в белке, а в микре (ИБФМ РАН).
Просто подумал, может где-то еще в нашей необъятной Родине фолдингом белка занимаются, ан нет.
Нет, от решения данной конкретной задачи человек Богом не станет, не бойтесь :) Так как нужно понять устройство живого на более высоких уровнях — на уровне клетки и тд. Разобраться, как все-таки мозг работает и так далее.
А для обОжения надо, по слову отцов, Духа Святого стяжать!
Пожалуйста, рад, что статья понравилась, я не минусовал :)
Предполагается, что если делать молекулярную динамику с правильными force fields, то должно свернуться в нативную (природную) конформацию. Proof of principle: The protein was initially configured in a fully extended state and was observed to fold to a stable conformation with a backbone root-mean-squared deviation (RMSD) of ~1 Å from the crystal structure. (с) www.sciencemag.org/content/330/6002/341.full?ijkey=s.yjp.RDsEAFk&keytype=ref&siteid=sci (RMSD в 1 ангстрем — это точно правильная структура, в пределах обычных флуктуаций белковой цепи)
Да, обратная трансляция — это полная эзотерика, официально ее нет. Есть несколько линий доказательства, почему обратная трансляция невозможна. Во-первых, функции значительного количества белков известны и такого фермента не обнаружено. Глядя на рибосому, делающую прямую трансляцию и весящую больше трех мегадальтон, 52 белка плюс длинные РНК, невольно предполагаешь, что обратную транскрипцию будет делать такая же махина и не заметить ее очень сложно. Во-вторых, синтез белка — многоступенчатый процесс, поэтому он термодинамически не может быть обращен, в отличие от одноступенчатых реакций (к которым, например, относится транскрипция — химически там образуется лишь фосфодиэфирная связь между нуклеотидами, реакция может быть легко обращена). Были еще какие-то свидетельства, которые нам читали, но уже плохо помню — давно это было :)
Да, именно так «минимизация энергии» и делается. Подходы в деталях отличаются, но суть в том, что ты уже двигаешь группы атомов, в том числе и расширенные до целого элемента вторичной структуры. Проблема тут в том, что при таком приближении система обычно сползает до ближайшего локального энергетического минимума, который совсем не есть глобальный минимум. Выпрыгнуть же из локального минимума такой подход пока не может, в этом вся проблема…
Так, а вот про обратную трансляцию можно поподробней? В официальной мэйнстримной науке вроде бы до сих пор этот процесс считается невозможным, отсюда и вера в идею «мира РНК».
Вопрос первый — в общем случае, не имея дополнительной информации — никак :) В реальности алгоритм такой — можно поискать гомологичные (сходные по первичной последовательности) белки, узнать, что они делают и от этого оттолкнуться. Если есть структура — такой же поиск структурных гомологов, может дать ответ на вопрос, но подтвердить функцию белка можно только в лаборатории, экспериментально. Далее, если нет гомологов с известной функцией, можно провести анализ окружения гена, кодирующего данный белок, в ДНК. Очень часто гены белков, участвующих в разных стадиях одного процесса, находятся на ДНК рядом (у бактерий это называется оперон), так можно хоть процесс определить. Если же совсем ничего не ясно, в бой идет тяжелая артиллерия — генетическая инженерия. Для начала обычно просто убивают нужный ген и смотрят, какой процесс в организме сломался, потом возможен более тонкий анализ мутантных версий белка и тд :)
Плюс возможный всякие скрининги — например, если есть подозрение, что белок взаимодействует с другими белками, можно прогнать Yeast 2 hybrid system и идентифицировать возможных партнеров, далее раскручивать от них.
Второй вопрос: стопроцентно — никак. Но можно предположить, как именно должны быть расположены атомы активного центра для осуществления нужной функции, а потом попытаться найти подходящий остов белка, который сможет поддерживать нужную структуру атомов активного центра. Сейчас это на уровне шаманства, люди меняли специфичности отдельных ферментов успешно и тд, но такая инженерия (успешная) — пока очень большая редкость.
Спасибо! Вопросы глубокие и точного ответа не имеющие, но в контексте эволюционной теории самой разумной отговоркой будет, что «так случайно получилось, а потом закрепилось». На самом деле аминокислоты могут спонтанно образоваться из неорганики (те самые опыты Миллера — http://ru.wikipedia.org/wiki/Эксперимент_Миллера_—_Юри ), плюс аминокислоты умеют даже спонтанно полимеризоваться в короткие пептиды в присутствии ионов меди. То есть их химия, скорее всего, оказалась самой «удобной» для эволюции, но точней ответить вряд ли можно. Репертуар боковых остатков аминокислот достаточно богат и позволяет катализировать множество реакций, но возникает вопрос, почему именно эти 20 аминокислот закрепились эволюцией? Ведь химически возможно существование бОльшего количества аминокислот, просто Природа не использует их в белках. Лучший ответ — так случайно получилось, то есть мы не знаем. Сторонники «intelligent design» немедленно указали бы, что здесь имеется лазейка для существования Творца. В плане же инженерии белка, сейчас поставлена такая задача — сделать искусственную систему трансляции, которая позволила бы включать в белки нестандартные аминокислоты, существенно расширяя каталитический репертуар белков. Первые успехи и proof of principle уже есть: www.nature.com/nature/journal/v464/n7287/full/nature08817.html
Спасибо! Уже поправил на «в основном на большом количестве нековалентных взаимодействий». Просто я использовал наш жаргонизм «слабое взаимодействие», как противоположность ковалентной связи.
Кстати, там выше я ссылался на лекции А.В. Финкельштейна по физике белка, он в том самом Институте белка работает.
В Пущино про БелОк (а это самый продвинутый институт там) много шуток. Например, «Чудесный город Пущино: магазин Зайчик, институт БЕлка» :)
Да, к сожалению, подходы, работающие у химиков для малых молекул (для биологов все, что меньше ~500 Дальтон — малая молекула), перестают эффективно работать для макромолекул (15-150 и больше килоДальтон) из-за вычислительной сложности. Приходится изобретать гиблые, но более быстрые костыли.
Это, кстати, отдельный вопрос — сколько проблем может быть решено просто увеличением доступной вычислительной мощности. Похоже, что фолдинг белка — одна из таких проблем.
В практическом плане это выглядит так — белок же не берется сам по себе с потолка, его продуцируют в бактериях или культуре эукариотических клеток, в которые засунут ген нужного белка так, чтобы бактерия или клетка вырабатывала его в больших количествах (по-научному — ген под контролем сильного промотора). Соответственно, в какой-то момент у нас есть несколько грамм бактерий, собранных после выращивания в паре литров среды. Мы эти бактерии суспендируем в некотором растворе и разрушаем их клеточную стенку и мембраны ультразвуком или специальным прессом (грубо говоря, клетки лопаются). В результате имеем растворимую фракцию белков и прочего клеточного содержимого плюс «осколки» клеток, которые нерастворимы. Растворимое отделяется от нерастворимого центрифугированием, а потом смотришь — есть ли твой белок в растворе или он находится вместе с осколками клеток в нерастворимом осадке. Обычно считается, что если белок не растворим, значит по какой-то причине он не смог свернуться, хотя реально никто не знает, в чем там точно дело. Как-то так. Причем хитро перебирая компоненты раствора иногда удается растворить нерастворимый белок. Но редко :(
Для проведения экспериментов, как Вы понимаете, нужен растворимый, функционально активный белок…
Второй вопрос — раньше именно так и считалось, однако сейчас потихоньку приходит понимание, что есть «intrinsically disordered proteins» — разупорядоченные белки, не имеющие выраженной трехмерной структуры и при этом выполняющие свои функции. Такие белки не могут быть ферментами, выполняющими катализ (для катализа нужна четкая структура), но они часто участвуют в белок-белковых взаимодействиях и регуляции клеточных процессов. Дело в том, что для связывания с другим белком структура не очень важна, так как структурированный белок может распознавать и связывать кусок несвернутого белка-партнера (BRCT domain, например). В свою очередь, на несвернутом белке могут быть сайты распознавания для нескольких разных структурированных белков и он может служить «затравкой» для образования биологически важного комплекса из нескольких белков. Связывание структурированных белков с неструктурированным, в свою очередь, может регулироваться белками-регуляторами за счет фофсорилирования неструктурированного белка, например.
Каждая аминокислота состоит из от 10 до почти 30 атомов, включая атомы водорода. То есть в среднем в белке несколько тысяч атомов, в крупных может быть больше десятка тысяч.
Если же запускать молекулярную динамику, то белок обычно помещают в «коробочку» из воды, так как взаимодействие с водой критично для белка (хотя раньше и в «вакууме» гоняли, но поняли, что это не кошерно). Соответственно, молдинамика в таких случаях еще должна все атомы воды просчитывать.
Просто подумал, может где-то еще в нашей необъятной Родине фолдингом белка занимаются, ан нет.
А для обОжения надо, по слову отцов, Духа Святого стяжать!
Предполагается, что если делать молекулярную динамику с правильными force fields, то должно свернуться в нативную (природную) конформацию. Proof of principle: The protein was initially configured in a fully extended state and was observed to fold to a stable conformation with a backbone root-mean-squared deviation (RMSD) of ~1 Å from the crystal structure. (с) www.sciencemag.org/content/330/6002/341.full?ijkey=s.yjp.RDsEAFk&keytype=ref&siteid=sci (RMSD в 1 ангстрем — это точно правильная структура, в пределах обычных флуктуаций белковой цепи)
Плюс возможный всякие скрининги — например, если есть подозрение, что белок взаимодействует с другими белками, можно прогнать Yeast 2 hybrid system и идентифицировать возможных партнеров, далее раскручивать от них.
Второй вопрос: стопроцентно — никак. Но можно предположить, как именно должны быть расположены атомы активного центра для осуществления нужной функции, а потом попытаться найти подходящий остов белка, который сможет поддерживать нужную структуру атомов активного центра. Сейчас это на уровне шаманства, люди меняли специфичности отдельных ферментов успешно и тд, но такая инженерия (успешная) — пока очень большая редкость.
Кстати, там выше я ссылался на лекции А.В. Финкельштейна по физике белка, он в том самом Институте белка работает.
В Пущино про БелОк (а это самый продвинутый институт там) много шуток. Например, «Чудесный город Пущино: магазин Зайчик, институт БЕлка» :)
Это, кстати, отдельный вопрос — сколько проблем может быть решено просто увеличением доступной вычислительной мощности. Похоже, что фолдинг белка — одна из таких проблем.